ICS 67.120 C 53 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 8222020 代替 DB34/T 822-2008动物组织中地西泮的残留测定 酶联免疫吸附法 Determination of diazepam residue in animal tissues Enzyme-linked immunosorbent assay 文稿版次选择 2020-08-03发布 2020-09-03实施安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 8222020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准代替 DB34/T 822-2008动物组织中地西泮的残留测定酶联免疫吸附法，除编辑性修改外主要技术变化如下：修改了标准名称，删除了标准名称中的连接符“-”；修改了试剂和溶液内容（见第 4 章）；将上一版本第 3 章试样制备和 7.1样品处理合并为第 6 章试样制备，优化了样品处理方法（见第 6 章）；增加了匀浆机、离心机的参数要求（见 5.2 和5.3）；修改百分吸光度值为相对吸光度，增加了稀释倍数换算描述（见第 8章）；提高了检测灵敏度，检测限修改为 1.0 g/kg（见 9.1），且删除了灵敏度在第 1 章中的表述；修改确认方法表述（见 10.2）。本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽华测检测技术有限公司、宁国市金鼎家庭农场、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽华澳生物技术有限公司、安徽省农产品质量安全检测中心、合肥市动物卫生监督所、安徽省水产技术推广总站、铜陵市义安区畜牧兽医局、宁国市自然资源和规划局。本标准主要起草人：许世富、郑新勇、李生龙、卞红正、何广、汪桃花、徐勇、许晓靖、孙德祥、刘红云、何为俊、王美娟。DB34/T 8222020 1 动物组织中地西泮的残留测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物肌肉、肝脏、肾脏中地西泮残留测定的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏中地西泮残留的快速测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 残留在组织中的地西泮经提取后，用于酶联免疫分析。试样中的地西泮抗原与包被于微孔板中的地西泮特异性抗体进行免疫竞争性反应，加入一定量的显色底物和终止液，在 450 nm 处进行吸光度测量，试样中地西泮的含量与颜色成反比。换算后可以获得样本中地西泮的含量。4 试剂和溶液 4.1 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。4.2 竞争酶标免疫法地西泮检测试剂盒 28冰箱中保存。4.2.1 微孔板：包被有地西泮抗体。4.2.2 地西泮标准溶液：1 g/mL。4.2.3 地西泮标准工作液：0 g/L，0.1 g/L，0.2 g/L，0.4 g/L，0.8 g/L，1.6 g/L。4.2.4 酶标二抗。4.2.5 抗体工作液。4.2.6 浓缩复溶液：0.5磷酸盐缓冲液。4.2.7 浓缩洗涤液：含 1.0吐温 20 的磷酸盐缓冲液（pH 为7.4）。4.2.8 底物 A 液：TMB 缓冲液。4.2.9 底物 B 液：双氧水溶液。4.2.10 显色剂。4.2.11 终止液：2 mol/L 的硫酸溶液。4.3 洗涤工作液：用水 20 倍稀释厂商提供的浓缩洗涤液。4.4 复溶工作液：用水 2 倍稀释厂商提供的浓缩复溶液。4.5 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液：称取 0.4 g 氢氧化钠，加水定容至 100 mL，混匀备用。4.6 正己烷。DB34/T 8222020 2 5 仪器设备 5.1 酶标仪（带 450 nm 滤光片）。5.2 匀浆机：10 000 rpm。5.3 离心机：5 000 rpm。5.4 分析天平：感量 0.01 g。5.5 氮吹仪。5.6 振荡器。5.7 离心管：20 mL。5.8 微量移液器及配套吸头：（单道 50 L，100 L，1 000 L，多道 50 L300 L）。6 试样制备 6.1 样品处理 动物肌肉、肝脏、肾脏，去筋后切成小块，制成肉糜后，10 000 rpm 均质 2 min，取 2 g 0.05 g 均质样品，加入 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液（4.5）8 mL，震荡混匀 5 min，5 000 rpm 离心 10 min，取 1 mL 上清液于另一离心管中，加入 10 mL 正己烷（4.6），震荡混匀 5 min，5 000 rpm 离心 5 min，取上层正己烷 5 mL，50氮气吹干，加 1 mL 样品复溶工作液（4.4）溶解，取 50 L 上清液用于检测。6.2 样品贮存 将试样按照测试和备用分别存放于-20-16条件下保存。7 测定步骤 7.1 测定在室温 2025条件下操作，测定之前将试剂盒以及所有试剂在室温（2025）下放置 1 h2 h。7.2 按标准样品和测定样品数量，取孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。7.3 在标准品和样品孔条中，分别加入 50 L 相对应的标准品或样品溶液。7.4 在所有孔中加入抗体工作液 50 L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应30 min。7.5 揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（4.3）250 L/孔，充分洗涤 4 次5 次，每次间隔 10 s，倾出板孔内洗涤液，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。7.6 加入酶标二抗 100 L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应 30 min，取出重复洗板步骤（7.5）。7.7 加入底物液 A 液 50 L/孔，再加入底物液 B 液 50 L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 25避光环境中反应 15 min（在加入底物液 A 液和底物液 B 液后，一般显色为 15 min；若颜色较浅，可延长反应时间到 20 min 或更长，但不得超过 25 min；反之，则减短反应时间）。7.8 加入终止液 50 L/孔，轻轻振荡混匀，5 min 内在 450 nm 下检测吸光度值。8 结果判定与表述 DB34/T 8222020 3 用获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）：按式（1）计算相对吸光度值：相对吸光度值（）=0 BB100.(1)式中：B 标准溶液或供试样品的吸光度值；Bo 空白（浓度为 0 标准溶液）的吸光度值。将计算的相对吸光度值（）对应地西泮标准溶液浓度（g/L）的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出。结果乘上相应的稀释倍数，即得样品中地西泮药物含量。9 检测方法灵敏度、准确度、精密度 9.1 灵敏度 本方法在动物肌肉、肝脏、肾脏中的检测限为 1.0 g/kg。9.2 准确度 本方法在 2.0 g/kg 添加浓度水平上的回收率为 80100。9.3 精密度 本方法的批内变异系数 CV 10，批间变异系数 CV 15。10 其他 10.1 本方法动物组织稀释倍数为 10。10.2 本方法为快速测定法，检测结果小于 1.0 g/kg 时可判为未检出，大于或等于 1.0 g/kg 时认为可疑，应使用色谱质谱联用法进行确认。10.3 试剂盒可能存在交叉反应，不同品牌的试剂盒，其操作步骤可能略有差别，具体操作步骤可根据试剂盒使用说明书略作调整。_