ICS 67 X 04 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 5189.8 2020 天然植物 提取物中 危害成分 检测 第8 部分：辣椒提 取物中苏 丹红的测 定 2020-06-28 发布 2020-07-28 实施 河 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB13/T 5189.8 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。DB13/T 5189 天然 植物 提 取物中 危害 成分 的测 定 共分12 个部 分：第1 部 分：亚硝 酸盐 的测 定；第2 部 分：二氧 化硫 的测 定；第3 部 分：正己 烷、丙酮、乙酸 乙酯、甲 醇和 乙 醇5 种有 机溶 剂残 留的 测定；第4 部 分：辣椒 提取 物中 砷、铅、镉、铬、汞 的测 定；第5 部 分：万寿 菊提 取物 中对氧 基苯 胺的 测定；第6 部 分：万寿 菊提 取物 中乙氧 基喹 啉的 测定；第7 部 分：天然 番茄 红中 苯并 芘 的测 定；第8 部 分：辣椒 提取 物中 苏丹红 的测 定；第9 部 分：辣椒 提取 物中 叔丁基 对苯 二酚 的测 定；第10 部分：辣 椒红 中赭 曲 霉毒 素 A 的 测定；第11 部分：叶 黄素 中苯 的 测定；第12 部分：甜 菊糖 苷中 邻 苯二甲 酸酯 的测 定。本部分 为DB13/T 5189的 第8部分。本标准 由河 北省 市场 监 督 管理局 提出 并归 口。本部分 起草 单位：晨 光生 物 科技集 团股 份有 限公 司、河 北省食 品检 验研 究院、石 家 庄海关 技术 中心、清河食 品药 品检 验所。本部分 主要 起草 人：连运 河、张 玉芬、史 国华、杨 清山、钱建 瑞、艾连 峰、郭焕君。DB13/T 5189.8 2020 1 天 然植物 提取物中 危害成 分检测 第 8 部分：辣椒提 取物中 苏丹红的 测定 1 范围 本部分 规定 了辣 椒提 取物 中苏丹 红、和 的超高 效液 相色 谱-串联 质 谱测定 方法。本部分 适用 于辣 椒提 取物 中苏丹 红、和 的测定。2 规范性 引用 文件 下列文 件 对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的 引 用文 件，仅注 日期 的 版本 适 用于 本 文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 修改单）适 用于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法。3 原理 辣椒提 取物 中的 苏丹 红经 环己烷 乙 酸乙 酯溶 解，凝胶色 谱净 化，再浓 缩至 干，用 乙腈 复溶，采 用C18（2.1 mm50 mm，1.7 m）色谱 柱，以 乙腈（0.1%）+甲酸 水（0.1%）为流动 相 体系，梯 度 洗脱，三重四 级杆 质谱 仪检 测，外标法 定量。4 试剂或 材料 除非另 有说 明，本方 法所 用试剂 均为 分析 纯，水为GB/T 6682规定 的 一级 水。4.1 试剂 4.1.1 甲酸（C2H2O2）：优级 纯。4.1.2 乙腈（C2H3N）：色谱 纯。4.1.3 环己烷（C6H12）。4.1.4 乙酸乙 酯（C4H8O2）。4.1.5 三氯甲 烷（CHCl3）。4.2 试剂配 制 环己烷 乙 酸乙 酯：1+1（体积比）：量取500 mL 环 己烷与500 mL 乙 酸乙 酯混 合均匀。4.3 标准品 4.3.1 苏丹红 标 准品（C16H12N2O，CAS 号：842-07-9）：纯 度大 于99.0%，或具 有标 准 物质证 书，20 常温储 藏。DB13/T 5189.8 2020 2 4.3.2 苏丹红 标 准品（C18H18N2O，CAS 号：3118-97-6）：纯度 大于99.0%，或 具有 标准 物 质证书，20 常温储 藏。4.3.3 苏丹红 标 准品（C22H16N4O，CAS 号：85-86-9）：纯 度大 于99.0%，或 具有 标准 物质证 书，20 常温储 藏。4.3.4 苏丹红 标 准品（C24H20N4O，CAS 号：85-83-6）：纯 度大 于99.0%，或 具有 标准 物质证 书，20 常温储 藏。4.4 标准溶 液配 制 4.4.1 混合标 准储 备液（100 mg/L）：称取 苏丹 红、苏丹 红、苏丹红 和 苏丹 红 标准 品 各10 mg（精确 至0.01 mg），加 入 5 mL 三 氯甲 烷促 溶，用 乙腈定 容 至100 mL，配制 成 100 mg/L 的 储备 液，于4 冰 箱中 冷藏 保存。4.4.2 混合标 准中 间溶 液（1 mg/L）：准确 量取100 mg/L 标准储 备 液1 mL 至100 mL 容量 瓶中，用 乙腈定容 至刻 度，充分 摇匀，得到 浓度 为1 mg/L 的 标 准中间 溶液。4.4.3 混合标 准使 用溶 液：准确 量取 1 mg/L 标 准中 间溶 液0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL至100 mL 容量 瓶中，用 乙 腈定容 至刻 度，充 分摇 匀，得到浓 度 为 1 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、50 g/L、100 g/L 的 系列标 准使 用液。5 仪器和 设备 5.1 超高效 液相 质谱 仪：配电 喷雾离 子源（ESI）。5.2 电子天 平：感量 为 0.1 mg 和0.01 mg。5.3 漩涡混 匀器。5.4 凝胶净 化色 谱仪（GPC）。6 试验步 骤 6.1 试样提 取 称取样 品0.1 g（精 确至0.1 mg）于25 mL 容 量瓶 中，加入环 己烷 乙 酸乙 酯：1+1（体 积比）定 容，超声溶 解，摇匀。上 清液 过0.45 m 有机 滤膜 后作 待 净化液。6.2 试样净 化 取待净 化液于GPC样 品管 中，进行GPC 净 化，进 样量5 mL，收 集洗脱 液，于40 下旋转 蒸发至 干。残渣用2 mL 乙腈 超声 溶解，过0.22 m有 机滤 膜，待 测。凝胶渗 透色 谱净 化参 考条 件如下：a)凝胶渗 透色 谱净 化系 统；b)凝胶柱 规 格400 mm25 mm（内径）；c)色谱柱 填 料Bio-Beads S-X3（38 75 m），50 g；d)流动相：环 己烷 乙 酸乙 酯：1+1（体积 比）；e)流速：5 mL/min；DB13/T 5189.8 2020 3 f)收集时 间：2537 min（具体时 间以 实际 标样 为准）。6.3 色谱质 谱参 考条 件 6.3.1 色谱参 考条 件 色谱参 考条 件如 下：a)色谱柱：C18 色 谱柱（2.1 mm50 mm，1.7 m），或 性能相 当者；b)流动相：A 0.1%甲 酸乙 腈，B 0.1%甲酸 水溶 液，线 性梯度 洗脱 条件 见 表 1；c)流速：0.35 mL/min；d)柱温：35；e)进样量：10 L。表1 梯 度洗 脱条 件 时间（min）A(%)B（%）0.0 70 30 0.5 70 30 1 80 20 5.5 80 20 5.6 100 0 7 100 0 7.1 70 30 8 70 30 6.3.2 质谱参 考条 件 质谱参 考条 件如 下：a)电离方 式：ESI+；b)离子源 温 度120；c)脱溶剂 温 度420；d)毛细管 电 压1.0 kv，；e)脱溶剂 气体 流 速 700 L/h；f)碰撞气 体流 速0.27 mL/min；定性定 量离 子、碰撞 电压、驻留 时间 见表2。表2 定 性定 量离 子、碰 撞 电压、驻留 时间 化合物 母离子 子离子 锥孔电压V 碰撞电压V 驻留时间（s）苏丹红 249.2 93.1 35 25 0.350 156.1 35 25 0.350 苏丹红 277.2 121.1 25 20 0.450 156.1 25 20 0.450 苏丹红 353.2 77 35 25 0.450 197.1 35 25 0.450 苏丹红 381.2 91.1 27 20 0.350 224.2 27 20 0.350 DB13/T 5189.8 2020 4 6.4 测定 6.4.1 定性 按照液 相色 谱质 谱/质谱 条 件测定 样液 和标 准工 作溶 液，外 标标 准曲 线法 测定 样 液中苏 丹红 的含 量。样品中 待测 物含 量应 在标 准曲线 范围 之内，如 果含 量超出 标准 曲线 范围，应 用空白 溶剂 进行 适当 稀释。在上述 色谱 条件 下，苏丹 红的质 量色 谱峰 保留 时间 分别约 为1.4 min、2.1 min、2.7 min、4.6 min。在相同试 验条 件下，样 品与 标准工 作液 中待 测物 质的 质量色 谱峰 相对 保留 时间 在2.5%以内，并 且在 扣 除 背景后的 样品质 量色 谱图中，所选 择的离 子对 均出现，同时 与标准 品的 相对丰 度允许 偏差不 超过 表3规定的范围，则 可判 断样 品中 存在对 应的 被测 物。四种 苏丹红 的液 相色 谱-质谱 总 离子流 图 见 附录A。表3 使 用液 相色 谱质 谱/质 谱定性 时相 对离 子丰 度最 大允许 误差 相对丰度（基峰）/%相对离子丰度最大允许误差/%50 2 0 大于20至小于等于50 2 5 大于10至小于等于20 3 0 小于等于10 5 0 6.4.2 定量 以标准 样品 浓度 为横 坐标，峰 面积 为纵 坐标，制 作 标准曲 线，从 标准 曲线 图 中查出 试样 溶液 中苏 丹红的相 应含 量。7 试验结 果 辣椒提 取物 中苏 丹红（苏 丹红、苏 丹红、苏丹 红 和 苏丹 红）含 量X 按式（1）计算。c VXM（1）式中：X 辣 椒提 取物 中苏 丹红 的含量，单 位为 微克 每千 克（g/kg）；c 从 标准 工作 曲线 查出 的试样 溶液 中苏 丹红 的浓 度，单 位为 微克 每升（g/L）；V 样 品的 最终 稀释 体积，单位 为毫 升（mL）；M 试 样质 量，单位 为克（g）。计算结 果以 重复 性条 件下 获得的 两次 独立 测定 结果 的算术 平均 值表 示，保留 至小数 点后 一位。8 精密度 在重复 性条 件下 获得 的两 次独立 测试 结果 的绝 对差 值不得 超过 算术 平均 值的35%。9 检出限 和定 量限 检出限 为0.1 mg/kg，定 量 限为0.3 mg/kg。DB13/T 5189.8 2020 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）四种苏 丹红 的液 相色 谱-质 谱总离 子流 图 四种苏 丹红 的液 相色 谱-质 谱总离 子流 图，如 图 A.1 所示。图A.1 四种 苏丹 红的 液相 色谱-质谱 总离 子流 图 _ 苏丹 红 4 苏丹 红 3 苏丹 红 2 苏丹 红 1