I C S 6 5.1 2 0C C S B 4 6湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 1 5 8 2 2 0 2 042饲 料 中 牛、羊 源 性 成 分 定 性 P C R 检 测 方 法D e t e c t i o n o f b o v i n e,o v i n e,c a p r i n e d e r i v e d m a t e r i a l s i n f e e d s t u f f s b y q u a l i t a t i v ep o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n(P C R)m e t h o d2 0 2 0-0 7-0 7 发 布 2 0 2 0-1 1-0 7 实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 I目 次前 言.I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 原 理.15 试 剂 和 材 料.16 仪 器 和 设 备.27 分 析 步 骤.38 结 果 分 析.59 结 果 判 定 与 表 述.51 0 P C R 产 物 测 序 结 果 判 定 与 表 述.51 1 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施.51 2 废 弃 物 处 理.5附 录 A（资 料 性）扩 增 产 物 序 列（来 源 N C B I）.6 F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口。本 文 件 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学、湖 北 省 畜 禽 产 品 质 量 监 督 检 验 测 试 中 心。本 文 件 主 要 起 草 人：刘 榜，王 文 君，刘 祖 红，金 秀 娥，付 明，周 翔，梁 昱，王 峻。本 文 件 实 施 中 的 疑 问 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅，联 系 电 话：0 2 7-8 7 6 6 5 8 2 1，邮 箱：h b s n a b 1 2 6.c o m；华 中 农 业 大 学，联 系 电 话：0 2 7-8 7 3 8 2 2 9 0，邮 箱：l i u b a n g m a i l.h z a u.e d u.c n。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 及 建 议 请 华 中 农 业 大 学，联 系 电 话：0 2 7-8 7 2 8 2 0 3 8，邮 箱：x y s m a i l.h z a u.e d u.c n。F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 1饲 料 中 牛、羊 源 性 成 分 定 性 P C R 检 测 方 法1 范 围本 文 件 规 定 了 饲 料 中 除 乳 制 品 以 外 的 牛（普 通 牛、瘤 牛、牦 牛 和 水 牛）、羊（绵 羊 和 山 羊）源 性 成分 的 定 性 P C R 检 测 方 法。本 文 件 适 用 于 饲 料 中 除 乳 制 品 以 外 的 牛（普 通 牛、瘤 牛、牦 牛 和 水 牛）、羊（绵 羊 和 山 羊）源 性 成分 的 定 性 P C R 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B/T 6 6 8 2 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法G B/T 1 4 6 9 9.1 饲 料 采 样G B/T 1 9 4 9 5.2 转 基 因 产 品 检 测 实 验 室 技 术 要 求G B/T 2 7 4 0 3-2 0 0 8 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 测3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4 原 理根 据 牛、羊 特 异 性 序 列，设 计 一 对 特 异 性 引 物，对 待 检 样 品 提 取 的 D N A 进 行 P C R 扩 增，依 据 扩 增 特 异性 片 段 的 结 果，判 断 待 检 样 品 中 是 否 含 有 牛 或 羊 源 性 成 分，并 可 根 据 片 段 大 小 差 异 进 而 判 断 是 牛 源 性 成分（1 2 5 b p），还 是 羊 源 性 成 分（1 0 7 b p）。5 试 剂 和 材 料5.1 除 另 有 规 定 外，试 剂 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂。实 验 用 水 符 合 G B/T 6 6 8 2 的 要 求。5.2 琼 脂 糖。5.3 G e l R e d 核 酸 染 料。注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料作为核酸电泳的染色剂。5.4 1 0 m o l/L 氢 氧 化 钠 溶 液：在 1 6 0 m L 水 中 加 入 8 0.0 g 氢 氧 化 钠（N a O H），溶 解 后 冷 却 至 室 温，再加 水 定 容 至 2 0 0 m L。F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 25.5 0.5 m o l/L 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠 溶 液（p H 8.0）：称 取 1 8.6 g 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠（E D T A-N a2），加入 7 0 m L 水 中，再 加 入 适 量 氢 氧 化 钠 溶 液（5.4），加 热 至 完 全 溶 解 后，冷 却 至 室 温，用 氢 氧 化 钠 溶 液（5.4）调 p H 至 8.0，加 水 定 容 至 1 0 0 m L。在 1 0 3.4 k P a（1 2 1）条 件 下 灭 菌 2 0 m i n。5.6 1 m o l/L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷-盐 酸 溶 液（p H 8.0）：称 取 1 2 1.1 g 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（T r i s）溶 解于 8 0 0 m L 水 中，用 盐 酸（H C l）调 p H 至 8.0，加 水 定 容 至 1 0 0 0 m L。在 1 0 3.4 k P a（1 2 1）条 件 下灭 菌 2 0 m i n。5.7 5 m o l/L 氯 化 钠 溶 液：称 取 2 9.2 2 g 氯 化 钠（N a C l）溶 于 8 0 m L 水 中，加 水 定 容 至 1 0 0 m L。在 1 0 3.4 k P a 蒸 汽 压（1 2 1）条 件 下 灭 菌 2 0 m i n。5.8 1 0%十 二 烷 基 磺 酸 钠 溶 液：称 取 1 0 g 十 二 烷 基 磺 酸 钠（C1 2H2 5S O4N a，S D S），加 入 8 0 m L 水 中，加热 至 完 全 溶 解 后，冷 却 至 室 温，加 水 定 容 至 1 0 0 m L。在 1 0 3.4 k P a 蒸 汽 压（1 2 1）条 件 下 灭 菌 2 0 m i n。5.9 D N A 提 取 细 胞 裂 解 液：量 取 2 0 0 m L 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠 溶 液（5.5），2 0 0 m L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷-盐 酸 溶 液（5.6），4 0 m L 氯 化 钠 溶 液（5.7），2 0 0 m L 十 二 烷 基 磺 酸 钠 溶 液（5.8），混 合 后 用 水 定 容至 1 0 0 0 m L，室 温 保 存，备 用。5.1 0 2 0 m g/m L 蛋 白 酶 K 溶 液：将 2 0 0 m g 蛋 白 酶 K（P r o t e i n a s e K）溶 于 9.5 m L 水 中，轻 摇 至 完 全溶 解 后，加 水 定 容 至 1 0 m L。于-2 0 保 存 备 用。5.1 1 硼 酸。5.1 2 T r i s-饱 和 酚。5.1 3 氯 仿：异 戊 醇(2 4:1)：将 氯 仿 和 异 戊 醇 按 照 2 4:1 的 比 例 配 制。5.1 4 无 水 乙 醇。5.1 5 7 5%乙 醇。5.1 6 T E 缓 冲 液（p H 8.0）：分 别 量 取 1 0 m L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷-盐 酸 溶 液（5.6）和 2 m L 乙 二 铵 四 乙酸 二 钠 溶 液（5.5）溶 液，加 水 定 容 至 1 0 0 0 m L。在 1 0 3.4 k P a（1 2 1）条 件 下 灭 菌 2 0 m i n。5.1 7 5 T B E 缓 冲 液：称 取 5 4 g 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（T r i s），加 入 2 7.5 g 硼 酸，先 用 5 0 0 m L 水 加 热搅 拌 溶 解 后，加 入 2 0 m L 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠 溶 液（5.5），用 1 0 m o l/L 氢 氧 化 钠 溶 液（5.4）调 p H 至8.0，然 后 加 水 定 容 到 1 0 0 0 m L。使 用 时 用 水 稀 释 成 0.5 T B E。5.1 8 T a q 酶。5.1 9 1 0 P C R 缓 冲 液。5.2 0 d N T P 混 合 液。5.2 1 6 D N A 上 样 缓 冲 液。5.2 2 D N A 分 子 量 标 记：可 清 楚 的 区 分 1 0 0 b p 1 0 0 0 b p 的 D N A 片 段。5.2 3 物 种 特 异 性 引 物（表 1）。5.2 4 引 物 溶 液：用 T E 缓 冲 液（5.1 6）或 水 分 别 将 引 物 稀 释 到 1 0 m o l/L。5.2 5 P C R 产 物 回 收 试 剂 盒。表 1 引 物 信 息引物名称 引物序列 片段大小/b p上游引物a 5-A T G G C T T A G G A C C C A G C T C T-3 牛 1 2 5、羊 1 0 7下游引物b 5-A C A Ra)C C A G A A C C T G G A T C G G A-3 aR=A/G,简并碱基。6 仪 器 和 设 备 F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 36.1 分 析 天 平：感 量 不 小 于 0.1 m g。6.2 P C R 扩 增 仪：升 降 温 速 度 1.5/s，孔 间 温 度 差 异 1.0。6.3 电 泳 槽、电 泳 仪 等 电 泳 装 置。6.4 紫 外 透 射 仪。6.5 紫 外 分 光 光 度 计。6.6 凝 胶 成 像 系 统 或 照 相 系 统。6.7 微 量 可 调 移 液 器：0.1 L 2.5 L，1 L 1 0 L，1 0 L 1 0 0 L，1 0 0 L 1 0 0 0 L。6.8 涡 旋 振 荡 器。6.9 离 心 机（最 大 离 心 力 1 2 0 0 0 g）。6.1 0 恒 温 水 浴 锅。7 分 析 步 骤7.1 样 品 采 集 与 制 备按 照 G B/T 1 4 6 9 9.1 采 样，粉 碎 并 充 分 混 合 均 匀 后，-2 0 保 存 备 用。7.2 D N A 模 板 制 备7.2.1 试 样 D N A 提 取试 样 D N A 提 取 步 骤 如 下：a)样 品 颗 粒 1 0 0 目 时 最 少 称 取 0.0 5 g，6 0 目 时 最 少 称 取 0.1 g，2 0 目 时 最 少 称 取 0.2 g；b)称 取 样 品 于 2 m L 离 心 管 中，加 入 1 m L 细 胞 裂 解 液（5.9），然 后 加 入 3 0 L 蛋 白 酶 K（5.1 0）溶 液，混 匀，5 6 消 化 6 h 1 0 h 至 无 明 显 组 织 块，4，1 2 0 0 0 g 离 心 1 0 m i n，取 上 清 移至 新 的 2 m L 离 心 管 中；c)加 入 等 体 积 的 T r i s-饱 和 酚（5.1 2），缓 慢 颠 倒 混 匀 1 0 m i n，4，1 2 0 0 0 g 离 心 1 0 m i n，取 上 清 液 移 至 新 的 2 m L 离 心 管 中；d)加 入 0.5 倍 体 积 的 T r i s-饱 和 酚（5.1 2）和 0.5 倍 体 积 的 氯 仿：异 戊 醇（2 4:1）（5.1 3），缓慢 颠 倒 混 匀 1 0 m i n，4，1 2 0 0 0 g 离 心 1 0 m i n；e)取 上 清 液 移 至 新 的 2 m L 离 心 管 中，加 入 等 体 积 的 氯 仿：异 戊 醇（2 4:1）（5.1 3），缓 慢 颠 倒混 匀 1 0 m i n，4，1 2 0 0 0 g 离 心 5 m i n；f)多 次 重 复 操 作 步 骤 e)，直 到 两 相 中 间 不 能 看 到 明 显 的 变 性 蛋 白 质 为 止，取 上 清 液 移 至 新 的 4 m L离 心 管 中；g)加 入 2 倍 体 积-2 0 预 冷 的 无 水 乙 醇（5.1 4），轻 轻 摇 晃 至 絮 状 沉 淀 析 出，1 2 0 0 0 g 离 心 5 m i n 1 0 m i n，倒 掉 上 清 液；h)加 入 1 m L 7 5%乙 醇（5.1 5）洗 涤 沉 淀，1 2 0 0 0 g 离 心 3 m i n，吸 去 上 清 液，重 复 1 次 2 次；i)室 温 下 放 置 使 残 余 乙 醇 完 全 挥 发，加 入 3 0 L 5 0 L T E 缓 冲 液（5.1 6）溶 解 D N A 沉 淀，-2 0 保 存 D N A 溶 液。7.2.2 D N A 质 量 评 估使 用 紫 外 分 光 光 度 计 对 试 样 D N A 的 质 量 进 行 评 估，检 测 2 6 0 n m 和 2 8 0 n m 处 的 吸 光 值 A 2 6 0 和 A 2 8 0，满足 以 下 要 求 则 适 宜 进 行 P C R 扩 增：a)D N A 浓 度 为 5 0 n g/L 1 0 0 0 n g/L；b)A 2 6 0/A 2 8 0 比 值 应 在 1.8 2.0 之 间。F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 47.3 P C R 反 应7.3.1 试 样 P C R 反 应7.3.1.1 每 个 试 样 P C R 反 应 设 置 3 个 平 行。7.3.1.2 在 P C R 反 应 管 中 按 表 2 依 次 加 入 反 应 试 剂，混 匀。也 可 采 用 经 验 证 的、等 效 的 定 性 P C R 反 应试 剂 盒 配 制 反 应 体 系。7.3.1.3 将 P C R 管 放 入 离 心 机 中，2 0 0 0 g 离 心 1 m i n，取 出 P C R 管 后，放 入 P C R 仪 中。7.3.1.4 进 行 P C R 反 应。反 应 程 序 为：9 5 预 变 性 5 m i n；9 5 变 性 3 0 s，6 2 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 1 5 s，共 进 行 3 5 次 循 环；7 2 延 伸 3 m i n；4 降 温 2 m i n。7.3.1.5 反 应 结 束 后 取 出 P C R 管，对 P C R 反 应 产 物 进 行 电 泳 检 测。表 2 P C R 检 测 反 应 体 系试剂 用量/L 终浓度双蒸水 1 3.51 0 B u f f e r 2 1 d N T P s 混合液（各 2.5 m m o l/L）1.6 各 0.2 m m o l/L5 U/L T a q 酶 0.1 0.0 2 5 U/L1 0 m o l/L 上游引物 0.4 0.2 m o l/L1 0 m o l/L 下游引物 0.4 0.2 m o l/L2 5 n g/L D N A 模板 2.0 2.5 n g/L总体积 2 0.0注：若采用定性P C R 试剂盒，则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系，但正向引物和反向引物用量按表2 执行。7.3.2 对 照 P C R 反 应在 试 样 P C R 反 应 的 同 时，应 设 置 阴 性 对 照、阳 性 对 照 和 空 白 对 照。分 别 以 牛 和 羊 的 基 因 组 D N A 作 为 阳 性 对 照；以 除 上 述 目 标 物 种 以 外 的 常 见 动 物 的 基 因 组 D N A 作 为 阴 性对 照；以 水 作 为 空 白 对 照。各 对 照 P C R 反 应 体 系 中，除 模 板 外，其 余 组 分 及 P C R 反 应 条 件 与 试 样 P C R（7.3.1）相 同。7.4 P C R 产 物 电 泳 检 测称 量 琼 脂 糖（5.2）适 量，加 入 0.5 T B E 缓 冲 液（5.1 7）至 终 浓 度 为 2 5 g/L，加 热 溶 解，配 制 成 琼脂 糖 溶 液。每 1 0 0 m L 琼 脂 糖 溶 液 中 加 入 5 L G e l R e d 核 酸 染 料（5.3），混 匀，稍 适 冷 却 后，将 其 倒 入电 泳 板 上，插 上 梳 板，室 温 下 凝 固 成 凝 胶 后，放 入 含 0.5 T B E 缓 冲 液（5.1 7）电 泳 槽 中，垂 直 向 上 轻 轻拔 去 梳 板。取 5 L P C R 产 物 与 1 L 6 D N A 上 样 缓 冲 液（5.2 1），混 合 后 加 入 凝 胶 点 样 孔，同 时 在 其中 一 个 点 样 孔 中 加 入 D N A 分 子 量 标 记（5.2 2），接 通 电 源，在 2 V/c m 5 V/c m 条 件 下 电 泳 检 测。7.5 凝 胶 成 像 分 析电 泳 结 束 后，取 出 琼 脂 糖 凝 胶，置 于 凝 胶 成 像 仪 上 成 像。根 据 D N A 分 子 量 标 记 判 断 扩 增 目 的 条 带 的片 段 大 小（表 1），将 电 泳 结 果 形 成 电 子 文 件 存 档。如 需 通 过 序 列 分 析 确 认 P C R 扩 增 片 段 是 否 为 目 的 D N A片 段，按 照 7.6 和 7.7 的 规 定 执 行。F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 57.6 P C R 产 物 回 收按 P C R 产 物 回 收 试 剂 盒 说 明 书，回 收 P C R 扩 增 的 D N A 片 段。7.7 P C R 产 物 测 序 验 证将 回 收 的 P C R 产 物 进 行 双 向 测 序，P C R 扩 增 引 物 作 为 测 序 引 物，测 序 原 理 同 S a n g e r 测 序 法。将 获 得 的序 列 分 别 与 牛 源 性 成 分 的 P C R 扩 增 产 物 序 列 和 羊 源 性 成 分 的 P C R 扩 增 产 物 序 列(附 录 A)进 行 比 对 和 结 果 判定。8 结 果 分 析阳 性 对 照 的 P C R 反 应 中 可 扩 增 出 与 预 期 大 小 一 致 的 D N A 片 段（分 别 为 牛 1 2 5 b p、羊 1 0 7 b p），而 阴 性对 照 及 空 白 对 照 中 均 未 扩 增 出 预 期 D N A 片 段，表 明 P C R 反 应 体 系 正 常 工 作，否 则 重 新 检 测。9 结 果 判 定 与 表 述9.1 阳 性 结 果 判 定 与 表 述 包 括：a)试 样 中 牛 的 特 异 性 D N A 序 列 得 到 扩 增，且 扩 增 片 段 大 小 与 牛 阳 性 对 照 的 1 2 5 b p 大 小 一 致，表明 样 品 中 检 测 出 牛 源 性 成 分，表 述 为“样 品 中 检 测 出 牛 源 性 成 分，结 果 为 阳 性”；b)试 样 中 羊 的 特 异 性 D N A 序 列 得 到 扩 增，且 扩 增 片 段 大 小 与 羊 阳 性 对 照 的 1 0 7 b p 大 小 一 致，表明 样 品 中 检 测 出 羊 源 性 成 分，表 述 为“样 品 中 检 测 出 羊 源 性 成 分，结 果 为 阳 性”。9.2 阴 性 结 果 判 定 与 表 述 包 括：a)试 样 中 牛 的 特 异 性 D N A 序 列 未 得 到 扩 增，或 扩 增 片 段 大 小 与 牛 阳 性 对 照 的 1 2 5 b p 大 小 不 一 致，表 明 样 品 中 未 检 测 出 牛 源 性 成 分，表 述 为“样 品 中 未 检 测 出 牛 源 性 成 分，结 果 为 阴 性”；b)试 样 中 羊 的 特 异 性 D N A 序 列 未 得 到 扩 增，或 扩 增 片 段 大 小 与 羊 阳 性 对 照 的 1 0 7 b p 大 小 不 一 致，表 明 样 品 中 未 检 测 出 羊 源 性 成 分，表 述 为“样 品 中 未 检 测 出 羊 源 性 成 分，结 果 为 阴 性”。注：3 个P C R 平行扩增的结果不一致的，应重复检测。重复检测结果仍不一致的，以多数结果为最终结果。1 0 P C R 产 物 测 序 结 果 判 定 与 表 述若 测 序 结 果 与 附 录 A 中 对 应 物 种 的 P C R 扩 增 产 物 序 列 的 符 合 程 度 在 9 0%以 上（含 9 0%），则 确 证 为 含 有对 应 物 种 源 性 成 分；若 结 果 符 合 程 度 在 9 0%以 下，则 确 证 为 不 含 有 对 应 物 种 源 性 成 分。1 1 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施按 照 G B/T 2 7 4 0 3-2 0 0 8 中 附 录 D 的 规 定 执 行。1 2 废 弃 物 处 理检 测 过 程 中 的 废 弃 物，收 集 后 按 照 G B/T 1 9 4 9 5.2 规 定 的 废 弃 物 处 理 要 求 进 行 无 害 化 处 理。F O R M T E X T D B 4 2/T F O R M T E X T 1 5 8 2 F O R M T E X T 2 0 2 0 6A A附 录 A（资 料 性）扩 增 产 物 序 列（来 源 N C B I）A.1 牛 源 性 成 分 的 P C R 扩 增 产 物 序 列（1 2 5 b p）：1 A T G G C T T A G G A C C C A G C T C T G C A G C C A T G G T T C G G G G C C T T G A G C T T C C C A G G T G T G C A G6 1 C T G C T G A T G G T G G A T T G G C A C T G A T C C G G G T G G T G T G G T G T G G T T C C G A T C C A G G T T C T G1 5 1 G T T G TA.2 羊 源 性 成 分 的 P C R 扩 增 产 物 序 列（1 0 7 b p）：1 A T G G C T T A G G A C C C A G C T C T G C A G C C A T G G T T T G G G G C C T G G A G A T T C C C A G G T T T G C A G6 1 C T G C T G A T G G T G G A T T G G T G T G T G G T T C C G A T C C A G G T T C T G G C T G T注：划线部分为引物序列所在位置。