ICS 65.0 20.30 B 43 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 19512019 水牛胚胎冷冻保存技术操作规程 Manipulation regulation for cryopreservation o f embryos in buffalo 2019-05-31 发布 2019-06-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 DB 45/T 1 95 1 20 19 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语和定 义.1 4 试剂、耗 材、设备和实验室要求.2 5 冷冻胚胎 的选择和标记.2 6 冷冻载体 的准备.3 7 胚胎的冷 冻.3 8 贮存与运 输.4 9 胚胎的解 冻.4 附录 A（规范 性附录）试剂、耗材和设备.6 附录 B（规范 性附录）胚胎冷冻和解冻液体.8 附录 C（规范 性附录）胚胎冷冻和解冻记录表.9DB 45/T 1 95 1 20 19 II 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区农业农村厅提出。本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区水牛研究所。本标准主要起草人：杨春艳、尚江华、郑海英、黄加祥、覃广胜、黄芬香、于农淇、梁贤威。DB 45/T 1 95 1 20 19 1 水牛胚胎冷冻保存技术操作规程 1 范围 本标准规定了水牛胚胎超低温冷冻技术规程，包括程序化冷冻和玻璃化冷冻技术要求。本标准适用于体内胚胎和通过体外受精、单精子胞质内显微受精、体细胞核移植技术生产的胚胎。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5 45 8 液氮生物容器 GB/T 2 58 81 牛胚胎 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 超低温保存 cr yo pr es erv at io n 将经冷冻保护剂处理的胚胎放置在19 6（液 氮）的超低温度中，使其新陈代谢暂时停止，从而 进行长期保存。3.2 体内胚胎 in v iv o em bry os 通过激素促进母畜超数排卵，再采用自然交配或人工授精，从母畜的输卵管或子宫角内回收发育到 一定时期的早期胚胎。3.3 水牛胚胎体外生产技术 in v it ro pr od ucti on,IV P 模拟水牛体内环境，在体外人工控制条件下，通过采集水牛卵巢上未成熟的卵母细胞经体外成熟培 养、精子体外获能、精卵体外受精和受精卵胚胎体外培养等技术生产胚胎。3.4 体外受精 in v it ro f ert il iz at io n,I VF 模拟体内环境使哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。DB 45/T 1 95 1 20 19 2 3.5 胞浆内单精子注射技术 in tr ac yt opl as mi c sp erm i nj ec ti on,IC SI 借助 显微 操作系统 将单一精子注 射入 卵子内使其受精的技术。3.6 体细胞核移植 s om at ic ce ll n uc lea r tr an sf er,SC NT 将一 个动 物的体细胞核移 入去 核的成熟卵母细胞中，产生与 供 体 动 物 遗传 成 份基 本一 致 的 动 物 后 代 技术。4 试剂、耗材、设备和实验室要求 4.1 试剂 所用试剂、药品以及 要求 见 附录A.1。4.2 耗材 所用耗材 见 附录A.2。4.3 设备 所用主要设备 见 附录A.3。4.4 实验室要求 工 作 区应设置准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室 等。其中，缓冲间面积 不 得小 于3 m 2，应 安 置 更衣柜 和 紫 外 灯，紫 外 灯强 度不 得 低 于 1.5 W/m 3。紫 外 灯 管 距地面 不应超过2.5 m，每次 照 射 时 间为 20 mi n 30 mi n。无菌 室的 无菌等级 最低标准应 达 到 万级，操作 区应 达 到 百级。5 冷冻胚胎的选择和标记 5.1 各胚胎发育阶段和质量等级的标记 5.1.1 胚胎发育 阶段划分 和胚胎 分级评 定应 符合 GB/T 25 88 1 的规定。水牛胚胎的发育时 间相较 于牛应 提前 12 h。胚胎冷冻前的质 量 应 达 到B 级（含 B 级）以 上。5.1.2 桑椹 胚（ML）、致密桑 椹 胚（C M）、早 期 囊 胚（E B）、囊 胚（B L）、扩张囊 胚（EX B）、孵 化 囊 胚(H B)的 缩写 应 统 一规范。5.2 不同种类胚胎的标记 体内胚胎标记 为 I VE，体 外受精胚标记 为 I VF，胞 质内单精子显微注 射 胚胎标记 为 IC S I，体细胞核 移 植胚胎标记 为S C N T。5.3 胚胎细管标记 5.3.1 细管上标记的胚胎 信息含 冷冻时 间、胚胎 种类、胚胎 个 数、发育 阶段、质 量。具 体标记 见如 下 示例：如 2 017 年 7 月 20 日冷冻 2 枚 A 级 I V F 扩张 囊 胚，其 登 记的序 号为 1 01，则标记 为 17 07 20 I VF 2 EX B DB 45/T 1 95 1 20 19 3 A 10 1。而 如果 是当天冷冻两枚 A 级 体细胞核移植扩张胚胎，其细胞供体牛的序号为 40 01，则 标记 为 17 07 20 S CN T 2 EX B A 40 0 1。5.3.2 同时做好详尽的胚胎冷冻表格，注明胚胎所有的相关信息，胚胎信息登记表见附录 C。6 冷冻载体的准备 6.1 程序化细管的准备 程序化冷冻细管材料应无毒、耐低温，细管规格以0.25 mL 为宜，细管外观正常、无变形、无裂痕，封口严密。6.2 玻璃化冷冻载体的准备 可 以 采用商 业化的玻璃 化冷冻载体；也可 以 采 用 0.2 5 mL 细 管，用刀片 将其一端斜 切，形 成一 截斜切面，以此切面作为玻璃化冷冻的载体，如图1所 示。图1 玻璃化冷冻载体 7 胚胎的冷冻 7.1 胚胎的程序化冷冻 7.1.1 胚胎的洗涤 将A级、B级 胚胎置于胚胎培养液中洗涤23次。7.1.2 胚胎的平衡 程序化胚胎冷冻液成分见附录B。将 洗涤后的胚胎放入冷冻液中，室温下平衡15 m in 20 mi n。7.1.3 胚胎的装管 将平衡后的胚胎装入0.25 mL 细管中，装管顺序为：冷冻液（2 cm 3 cm）气 泡（0.2 cm 0.5 cm）冷冻液加胚胎（6 cm 7 cm）气泡（0.2 cm 0.5 cm）冷冻 液（2 cm 3 cm），再用 封口粉沾水封 口。每支细管可装12 枚发育状况与供体相同的胚胎，如图2所示。图2 胚胎的装管顺序 DB 45/T 1 95 1 20 19 4 7.1.4 冷冻程序 将 装好 胚胎的冷冻细管 装入 加 好 液氮的程序化 降 温 仪 内，棉塞 一 头朝 上或 者朝 外，以 4/mi n 的 速 率降至-7，用 镊 子 缠 好灭菌棉，浸入 液氮，迅速接触 细管 棉塞 和冷 冻液的交 界面 进行植 冰。植 冰后在-7 平衡 5 mi n，以 0.3/mi n 的 降 温 速率降至-36 后，直接 将细管 投入 液氮内。7.2 胚胎的玻璃化冷冻 7.2.1 液氮的准备 取 一保温 壶，将液氮加 至约三分之二 处，盖好后 备用。7.2.2 冷冻平衡液和冷冻液的准备 取 一 塑料 平皿，分别 加 入 3 滴各 10 0 L 的冷冻 平衡 液和 3 滴各 10 0 L 的冷 冻液，室温 下 平衡 5 min 10 mi n。7.2.3 冷冻胚胎的平衡 胚胎在胚胎 培养液内 清洗 2 3 次后，转至平衡 液 滴 内 清洗 2 次，再将 清洗 后 的胚胎 转入第三滴 平衡 液内在室温下保 持 5 mi n。7.2.4 玻璃化冷冻步骤 平衡后 的胚胎用胚胎冷冻液 清洗两次后，吸取 胚胎和少 量 的冷冻液（不 宜 超过1 L），在 体 视 显微 镜 下放置在冷冻载体的 截面 上，如果 冷冻液过 多 可 吸除部分 冷冻液。再将 带 有胚胎的一 端浸入 液氮，保 持 3 s，再将 整个 载体 浸没入 液氮。8 贮存与运输 8.1 贮存冻胚和液氮的生物容器 均 不可 叠 放。用液氮生物容器贮存时，细管应 完全浸没 到液氮中。液 氮容器应 符合 GB/T 5 45 8 的规定。8.2 移 动 液氮生物容器时，应 轻拿轻 放，防 止 冲撞、震动 和 倾倒。8.3 运输时，应有 专 人 负责，途 中应 及 时 检查 和 补充 液氮。运输过程中注 意防挤压、防 冻、防雨淋、防晒、通 风散热。9 胚胎的解冻 9.1 程序化冷冻胚胎的解冻 9.1.1 解冻液的准备 解冻液 为常 规的胚胎培养液，在胚胎解冻前2 h 将胚胎培养液 作 一1 0 0 L 微 滴，并覆盖石蜡油，放入 培养 箱平衡 备用。9.1.2 细管的解冻 将胚胎细管 空气浴 10 s后 置于35 37 水 浴 中，浸浴 30 s至 胚 胎冷冻细管 彻底溶 化。用 消毒卫 生 纸擦干 细管，剪去封 口 端，将胚胎 推入 培养 皿 中；在体 视 显微 镜 下 挑取 胚胎。胚胎培养液 清洗 3 次以后，转入 微 滴 内培养 复苏。DB 45/T 1 95 1 20 19 5 9.2 玻璃化冷冻胚胎的解冻 9.2.1 在胚胎解冻前 2 h 将胚胎 培养液作一1 0 0 L 微滴，并覆盖石蜡油，放入培养箱平衡备用。9.2.2 将玻璃化胚胎解冻液在培养皿上作 4 个各 10 0 L 的微滴。从液氮内取出冷冻细管，空气浴 3 s，将带有胚胎的一端放入微滴内轻轻晃动，在体视显微镜下见胚胎脱出后，将胚胎取出用解冻液清洗 3 次，放入解冻液内停留 5 mi n，再用胚 胎培养液清洗 3 次，转入 微滴内培养复苏。9.3 胚胎的复苏检测 胚胎解冻后在体视显微镜下观察，解 冻 后的胚胎发育阶段和质量应符合GB/T 25 88 1 规定，胚胎解冻 信息详见附录C。DB 45/T 1 95 1 20 19 6 A A 附 录 A（规范性附录）试剂、耗材和设备 A.1 主要试剂及要求 A.1.1 试剂名称 乙 二 醇（E G）、二 甲 基 亚砜（D MS O）、海 藻糖、蔗糖、T C M 19 9、胎牛 血 清（F B S）、牛 血 清 白蛋白（B S A）。A.1.2 试剂要求 所用的试剂 除 特殊 规定外，均为分 析纯 及 其 以 上 纯 度的化 学 试剂，符合 组织 细胞培养要求。TC M 199、胎牛 血 清等推 荐 选用胚胎培养 测 试的产 品。A.1.3 胚胎体外培养液 推 荐 使用TC M 19 9（含 25 mM HE P ES 和0.26 mM N a H C O 3）+10 F B S。A.1.4 血清的灭活处理 新 购 的胎牛 血 清，已 注 明灭 活 处理的，用0.4 5 m 滤 器过 滤 灭菌后，可 以直接 使用；未注 明灭 活 处 理的，需 56 水 浴灭 活 30 min，用 0.45 m 滤 器过 滤 灭菌后 使用。血 清 经 灭 活 及 过 滤 灭菌后，分装 并 于-20 或-80 超低温 冰箱 中长期保存备用。A.2 主要耗材 如 下：玻璃培养 皿：f 20 mm；塑料 培养 皿（pe rt i d ish）：f 35 mm、f 60 mm；滤 器：f 0.22 m、f 0.45 m；加 样 器 枪 头（2 L，2 0 L，2 00 L，1 00 0 L）；加 样 器 枪 头 盒（2 L，20 L，2 00 L，1 00 0 L）；0.25 mL 塑料 胚胎 麦 管；胚胎 吸 管；玻璃细管：f 5 mm；透 明 硅胶软 管；脱 脂 棉；纱布；封 口 膜；标 签 纸；记 号 笔；一 次 性 乳 胶 或 P E 手套。DB 45/T 1 95 1 20 19 7 A.3 主要设备 如下：体视显微镜；CO 2培 养 箱；冰箱或冰柜；超净工作台；恒温热台；低温冰箱；电子分析天平（至少精确到0.0 1 mg）；加样器（2 L，2 0 L，20 0 L，1 00 0 L）；超纯水仪；电热恒温水浴锅；液氮生物容器；酒精灯。DB 45/T 1 95 1 20 19 8 B B 附 录 B（规范性附录）胚胎冷冻和解冻液体 B.1 程序化冷冻液 B.1.1 配 方 为 TC M 199 0.05 M 海 藻糖 1.8 M 乙 二 醇 0.4 B S A。B.1.2 取 18 mL 的T C M 19 9，加 入 0.37 8 g 海 藻糖、2 mL 乙 二 醇、0.08 g B S A，用 枪 头 或 者吸 管 吹 吸充分 混匀，再用0.22 m 滤 器过 滤 入无菌 容器内，置于4 冰箱 冷 藏 保存。B.2 玻璃化冷冻平衡液 B.2.1 配 方 为 TC M 199 10 F B S 20 E G 5 D MS O。B.2.2 采用TC M 19 9 添 加10 F B S 作为基 础 液。取 7.5 mL 基 础 液加 入 2 mL D MS O（二 甲 基 亚砜）和0.5 mL 的 E G（乙 二 醇），用 枪 头 或 者吸 管 吹 吸充分 混匀，再用0.22 m 滤 器过 滤 入无菌 容器内，置于 冰箱 冷 藏 保存。B.3 玻璃化冷冻胚胎冷冻保存液 B.3.1 配 方 为 TC M 199 10 F B S 20 E G 20 D MS O 0.0 5 M 蔗糖。B.3.2 采用TC M 19 9 添 加10 F B S 作为基 础 液。取 6 mL 基 础 液加 入 2 mL D MS O（二 甲 基 亚砜）和 2 mL 的 E G（乙 二 醇），称 取 1.711 5 g 的 蔗糖 加 入 混 合 液，用 枪 头 或 者吸 管 吹 吸 使 蔗糖 溶 解 并充分 混匀，再用0.22 m 滤 器过 滤 入无菌 容器内，置于 冰箱 冷 藏 保存。B.4 玻璃化冷冻胚胎解冻液 B.4.1 配 方 为 TC M 199 10 F B S 0.05 M 蔗糖。B.4.2 采用T C M 19 9 添 加1 0 F B S 作为基 础 液。取 10 mL 基 础 液加 入 1.71 1 5 g蔗糖，用 枪 头 或 者吸 管 吹 吸 使 蔗糖 溶 解 并充分 混匀，再用0.22 m 滤 器过 滤 入无 菌 容器内，置于 冰箱 冷 藏 保存。DB 45/T 1 95 1 20 19 9 C C 附 录 C（规范性附录）胚胎冷冻和解冻记录表 见表C.1、表 C.2。表C.1 胚胎信息登记表 序号 胚胎种类 母本 父本 胚龄 发育阶段 质量 冷冻时 间 胚胎数 量 冷冻方 法 液氮罐 编号 备注 表C.2 冷冻胚胎解冻记录表 序号 胚胎冷冻信息 冷冻时间 解冻时间 解冻后质量 胚胎用途 移植受体 备注 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 水牛胚胎冷冻保存技术操作规程 DB45/T 1951 2019 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究