I C S 6 5.0 2 0.3 0C C S B 4 1DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 1 5 9 2 2 0 2 0鸭 坦 布 苏 病 毒 双 抗 夹 心 E L I S A 抗 原 检 测规 程T e c h n i c a l p r o c e d u r e s o f t h e d o u b l e a n t i b o d y s a n d w i c h E L I S A a s s a y s f o r d e t e c t i o n o fd u c k t e m b u s u v i r u s（报批稿）2 0 2 0-0 7-0 7 发 布 2 0 2 0-1 1-0 7 实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 4 2/T X X X X-X X X XI目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 试 剂 和 材 料.15 抗 体 包 被 板 的 制 备.26 待 检 样 品 处 理.27 检 测 步 骤.28 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施.2附 录 A（资 料 性）鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备.4附 录 B（资 料 性）对 照 品 的 制 备.8附 录 C（规 范 性）试 剂 的 配 制.1 0D B 4 2/T X X X X-X X X XI I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口。本 文 件 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学、武 汉 科 前 生 物 股 份 有 限 公 司。本 文 件 主 要 起 草 人：金 梅 林、孙 小 云、陈 伦 勇、张 雪、孙 小 美、但 汉 并、赵 联 忠、李 冉、董 晓 辉、徐 高 原。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问，可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅，联 系 电 话：0 2 7-8 7 6 6 5 8 2 1，邮 箱：h b s n a b 1 2 6.c o m；华 中 农 业 大 学，联 系 电 话：0 2 7-8 7 2 8 2 0 3 8，邮 箱：x y s m a i l.h z a u.e d u.c n。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学，电 话：0 2 7-8 7 2 8 6 9 0 5，邮 箱：j m l 8 3 2 8 1 2 6.c o m。D B 4 2/T X X X X-X X X XI I I引 言鸭 坦 布 苏 病 毒 病（D u c k T e m b u s u V i r u s D i s e a s e）是 主 要 引 起 蛋 鸭 产 蛋 量 急 剧 下 降 的 一 种 疾 病，严重 的 则 会 出 现 绝 产。该 病 传 播 极 为 迅 速，短 时 间 内 波 及 全 群，发 病 率 高 达 1 0 0%，死 亡 淘 汰 率 则 根 据 不 同的 品 种 在 2%-5 5%之 间。在 2 0 1 1 年 召 开 的 第 一 届 水 禽 疫 病 防 控 研 讨 会 期 间，中 国 畜 牧 兽 医 学 会 将 该 传 染病 正 式 统 一 命 名，称 为“鸭 坦 布 苏 病 毒 病”。鸭 坦 布 苏 病 毒 病 的 疾 病 传 播 特 点 和 危 害 使 得 病 原 的 监 测 和 检 测 成 为 各 地 疫 控 部 门 和 各 个 规 模 化 养殖 场 的 重 要 工 作 之 一。D B 4 2/T X X X X-X X X X1鸭 坦 布 苏 病 毒 双 抗 夹 心 E L I S A 抗 原 检 测 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 鸭 坦 布 苏 病 毒 双 抗 夹 心 E L I S A 抗 原 检 测 的 术 语 和 定 义、试 剂 和 材 料、抗 体 包 被 板 的 制备、待 检 样 品 处 理、检 测 步 骤、废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施。本 文 件 适 用 于 鸭 坦 布 苏 病 毒 病 原 的 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法。3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1 鸭 坦 布 苏 病 毒 T e m b u s u v i r u s鸭 坦 布 苏 病 毒 是 一 种 急 性 传 染 病，以 蛋 鸭、种 鸭 产 蛋 骤 然 下 降 为 主 要 临 床 特 征、以 出 血 性 卵 巢 炎 为主 要 病 变 特 征。3.2 酶 联 免 疫 吸 附 法 E n z y m e-l i n k e d i m m u n e s o r b e n t a s s a y酶 联 免 疫 吸 附 法 是 将 抗 原 抗 体 反 应 的 高 度 特 异 性 与 酶 标 记 技 术 相 结 合，将 已 知 的 抗 原 或 抗 体 标 记 上酶 示 踪 物 质，利 用 酶 对 底 物 的 高 效 催 化 作 用，通 过 酶 标 仪 测 定 酶 分 解 底 物 产 生 的 有 色 物 质 的 光 密 度 值，计 算 抗 原 或 抗 体 的 含 量。3.3 6 3 0 n m 吸 光 度 值 O p t i c a l d e n s i t y a t 6 3 0 n mO D 值 表 示 被 检 测 物 吸 收 掉 的 光 密 度，是 检 测 方 法 里 的 专 有 名 词，检 测 单 位 用 O D 值 表 示，O D=l g(1/t r a n s)，其 中 t r a n s 为 检 测 物 的 透 光 值,因 此 又 叫 通 光 率。6 3 0 n m 吸 光 度 值 即 为 在 6 3 0 n m 的 波 长下 测 O D 值。4 试 剂 和 材 料4.1 试 剂鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体、辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体、T M B 底 物 显 色 液、终止 液、阳 性 对 照 品、阴 性 对 照 品、样 品 稀 释 液、2 0 倍 浓 缩 洗 涤 液、碳 酸 盐 包 被 液、封 闭 液。鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 制 备、纯 化 及 H R P 标 记 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 制 备 方 法 见 附 录 A。D B 4 2/T X X X X-X X X X2阳 性 对 照 品、阴 性 对 照 品 的 制 备 方 法 见 附 录 B。试 剂 配 方 见 附 录 C。4.2 仪 器 设 备 及 耗 材离 心 机（1 2 0 0 0 r p m）、恒 温 箱（3 7）、聚 苯 乙 烯 微 量 反 应 板（9 6 孔）、酶 标 仪（6 3 0 n m 波 长）、多道 移 液 器（3 0 0 L）、单 道 移 液 器（1 0 0 L、1 m L）。5 抗 体 包 被 板 的 制 备5.1 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 包 被将 纯 化 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 用 碳 酸 盐 包 被 液 稀 释 至 5.9 8 n g/L，每 孔 加 1 0 0 L，置 于 2 8 冰 箱 静 置 1 2 h 1 5 h。5.2 包 被 板 的 封 闭弃 净 包 被 板 中 所 有 的 液 体，每 孔 加 入 封 闭 液 2 0 0 L，置 于 3 7 恒 温 箱 静 置 2 h；再 次 弃 净 包 被 板 中 所有 的 液 体，将 包 被 板 静 置 于 3 7 恒 温 箱 2 h。6 待 检 样 品 处 理6.1 拭 子 样 品 的 处 理在 装 有 拭 子 的 离 心 管 中，加 入 5 0 0 L 样 品 稀 释 液，充 分 振 荡 涡 旋 后，1 0 0 0 0 r p m 离 心 3 m i n，弃 沉 淀，取 1 0 0 L 上 清 进 行 检 测。6.2 组 织 样 品 的 处 理每 份 组 织 样 品 取 1 g，加 入 2 m L 样 品 稀 释 液，研 磨 匀 浆，1 2 0 0 0 r p m 离 心 2 m i n，取 上 清，再 次 1 2 0 0 0 r pm离心3min，取 1 0 0 L 上 清 进 行 检 测。7 检 测 步 骤7.1 取 制 备 好 的 抗 体 包 被 板，用 洗 涤 液 洗 涤 3 次，弃 净 孔 中 液 体，将 处 理 好 的 待 检 样 品、阴 性 对 照 和阳 性 对 照 各 取 1 0 0 L 加 至 抗 体 包 被 板 中，阴、阳 性 对 照 各 设 2 孔，置 3 7 恒 温 箱 中 下 温 育 6 0 m i n。7.2 弃 去 孔 中 液 体，每 孔 加 入 洗 涤 液 3 0 0 L/孔，重 复 洗 涤 5 次。7.3 将 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 用 封 闭 液 稀 释 到 工 作 浓 度，1 0 0 L/孔，置 3 7 恒 温 箱 中 温 育 6 0 m i n。7.4 重 复 步 骤 7.2。7.5 每 个 反 应 孔 中 加 入 底 物 显 色 液 1 0 0 L，置 2 0 2 5 恒 温 箱 中 避 光 显 色 1 0 m i n。7.6 每 孔 加 入 终 止 液 5 0 L。7.7 用 酶 标 仪 在 波 长 6 3 0 n m 处 测 定 各 孔 的 O D 值。7.8 检 验 结 果 的 判 定，当 S（样 品 O D6 3 0 n m）/N（阴 性 对 照 O D6 3 0 n m）2，阴 性 对 照 O D6 3 0 n m 0.2 5 时 试 验 成立，样 品 检 测 结 果 判 为 阳 性；当 S（样 品 O D6 3 0 n m）/N（阴 性 对 照 O D6 3 0 n m）2，阴 性 对 照 O D6 3 0 n m 0.2 5 时，样 品 检 测 结 果 判 为 阴 性。D B 4 2/T X X X X-X X X X38 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施8.1 试 验 完 毕，酶 标 板，移 液 器 吸 头，样 品 处 理 时 使 用 过 的 离 心 管 等 耗 材 须 高 温 高 压 灭 菌 处 理。8.2 试 验 过 程 中 丢 弃 的 废 液 须 加 入 8 4 消 毒 液 或 新 洁 尔 灭 彻 底 消 毒。D B 4 2/T X X X X-X X X X4附 录 A（资 料 性）鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备A.1 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备A.1.1 免 疫 小 鼠用 超 离 纯 化 灭 活 的 鸭 坦 布 苏 全 病 毒 免 疫 6 周 龄-8 周 龄 雌 性 B A L B/c 小 鼠，免 疫 剂 量 为 1 0 0 n g/只。取 适量 的 纯 化 病 毒 溶 液 用 P B S 稀 释 后 加 入 等 体 积 的 弗 氏 完 全 佐 剂 充 分 乳 化 后 颈 背 部 皮 下 多 点 接 种，每 只 接 种2 0 0 L。首 免 两 周 后 再 次 免 疫，剂 量 同 于 首 次，与 弗 氏 不 完 全 佐 剂 体 积 比 1:1 充 分 乳 化 后 接 种，两 周 后再 次 进 行 三 免，免 疫 剂 量 及 佐 剂 的 选 择 同 于 第 二 次 免 疫，三 免 后 一 周 尾 静 脉 采 全 血 5 L，溶 于 2 0 0 L P B S中，混 匀，依 次 倍 比 稀 释 加 入 到 用 纯 化 的 D T M U V 全 病 毒 液 包 被 的 酶 标 板 中 测 定 小 鼠 的 血 清 抗 体 效 价，取效 价 最 高 的 小 鼠，加 强 免 疫，免 疫 剂 量 为 1 0 0 n g，不 加 佐 剂，直 接 腹 腔 注 射，7 2 h 后 进 行 融 合 试 验。A.1.2 饲 养 脾 细 胞 及 免 疫 脾 细 胞 的 制 备取 饲 养 小 鼠 及 免 疫 小 鼠，分 别 摘 眼 球 采 血，分 离 血 清 作 为 阴/阳 性 血 清 备 用。拉 颈 致 死 后 浸 于 7 5%酒 精 浸 泡 1 0 m i n。将 小 鼠 腹 部 向 上 右 侧 位 卧 放，用 消 毒 的 注 射 器 针 头 固 定 其 四 肢。小 心 打 开 其 腹 腔，无菌 取 出 脾 脏，置 于 研 磨 器 中 加 1 0 m L R P M I 1 6 4 0 溶 液 研 磨，静 置 2-3 m i n 后 吸 出 上 清 于 无 菌 5 0 m L E P 管 内，再 加 入 1 0 m L 1 6 4 0 研 磨 静 置 2 m i n 后 取 上 清 加 入 无 菌 E P 管 内，将 上 清 1 0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n，去 除 上 清 获 得 饲 养脾 细 胞 和 免 疫 脾 细 胞。在 饲 养 细 胞 中 加 入 5 0 m L H A T 溶 液，轻 轻 混 匀，置 于 3 7 温 箱。在 免 疫 脾 细 胞 中 加入 5 0 m L R P M I 1 6 4 0 溶 液，轻 轻 混 匀。将 瘤 细 胞 上 清 弃 去，将 免 疫 脾 细 胞 溶 液 加 入 其 中，轻 轻 混 匀，1 0 0 0 r p m，离 心 1 0 m i n，去 除 上 清。A.1.3 融 合 试 验轻 轻 用 手 指 叩 击 装 有 免 疫 脾 细 胞 及 S P 2/O 细 胞 的 E P 管 底，使 混 合 细 胞 松 动，将 E P 管 浸 入 3 7 温 水 中，用 巴 氏 管 吸 取 预 热 的 P E G 1 4 5 0 溶 液 1 m L，边 轻 轻 搅 动 细 胞 边 滴 加 溶 液，1 m i n 内 匀 速 加 完，继 续 搅 3 0 s，静置 3 0 s 后 边 搅 拌 边 加 入 预 热 的 1 6 4 0 溶 液，8 m i n 内 加 入 4 0 m L 1 6 4 0 以 终 止 反 应。1 0 0 0 r p m 1 0 m i n，去 除 上 清，加 入 5 0 m L 预 热 的 H A T 溶 液，轻 轻 混 匀。取 一 个 无 菌 试 剂 瓶，将 饲 养 细 胞 和 融 合 细 胞 加 入 混 匀，分 铺 于 9 6孔 板 中，每 孔 1 0 0 L，每 孔 再 补 加 一 滴 完 全 培 养 基，将 细 胞 板 置 于 3 7 C O2培 养 箱 中 静 置 培 养。每 天 观察 杂 交 瘤 细 胞 的 生 长 情 况，在 融 合 后 第 5 天 用 H A T 培 养 基 进 行 半 换 液，第 1 0 天 用 H T 培 养 基 将 H A T 培 养 液 全部 换 出，待 杂 交 瘤 细 胞 长 至 孔 底 的 1/3 1/2 时，取 1 0 0 L 细 胞 上 清 进 行 检 测。A.1.4 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 的 筛 选A.1.4.1 间 接 E L I S A 检 测 方 法 的 确 定用 方 阵 法 确 定 包 被 原 和 血 清 的 工 作 浓 度。取 超 离 纯 化 的 D T M U V 全 病 毒 液 作 为 抗 原，用 碳 酸 盐 包 被 液 按 1:5 0 稀 释，按 每 孔 1 0 0 L 添 加 到 9 6 孔 酶标 板 第 一 列 中，提 前 在 每 孔 内 加 入 1 0 0 L 包 被 液，从 第 一 列 取 1 0 0 L 稀 释 的 抗 原 加 入 到 第 二 列，混 匀 后D B 4 2/T X X X X-X X X X5再 取 1 0 0 L 至 第 三 列，依 次 倍 比 稀 释 至 1:2 0 4 8 0 0，同 时 按 同 样 的 方 式 包 被 两 块 酶 标 板，置 4 过 夜。次日 将 包 被 好 的 酶 标 板 用 P B S-T 洗 涤，每 孔 加 入 1 2 0 L 白 保 护 剂 B S A 封 闭 溶 液，3 7 孵 育 2 h，进 行 封 闭。再次 洗 涤 拍 干。将 分 离 保 存 的 免 疫 小 鼠 和 饲 养 小 鼠 的 血 清 分 别 作 为 阳 性 和 阴 性 血 清，用 P B S 按 1:5 0 倍 稀 释，第 一 行 每 孔 加 入 2 0 0 L，余 孔 提 前 加 入 1 0 0 L P B S，从 第 一 行 取 1 0 0 L 到 第 二 行 开 始 倍 比 稀 释 至 1:6 4 0 0，3 7 度 孵 育 1 h，洗 板 后 加 入 1:5 0 0 0 稀 释 的 H R P 标 记 的 羊 抗 鼠 I g G，3 7 孵 育 1 h，洗 板 后 加 入 T M B 底 物 显 色 液，1 0 m i n-1 5 m i n 后 加 入 2 m o l/L 稀 H2S O4溶 液 终 止 反 应。读 取 O D6 3 0 n m数 值。按 照 P/N 值 最 大 原 则，确 定 病 毒 液 的最 佳 包 被 浓 度。A.1.4.2 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 的 筛 选按 方 阵 法 确 定 的 抗 原 包 被 浓 度 包 被 一 批 酶 标 板，封 闭 处 理 后 4 度 保 存。取 融 合 细 胞 上 清 1 0 0 L 按 标记 好 的 顺 序 加 入 到 病 毒 和 空 白 辅 筛 酶 标 板 中，按 间 接 E L I S A 方 法 进 行 检 测，同 时 用 1.2 中 饲 养 小 鼠 和 免 疫小 鼠 的 血 清 分 别 作 阴 阳 性 对 照。A.1.4.3 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 的 克 隆将 通 过 检 测 初 步 确 定 为 阳 性 的 杂 交 瘤 细 胞 采 用 倍 比 稀 释 法 进 行 亚 克 隆。轻 轻 吹 落 9 6 孔 内 细 胞，取1 0 0 L 至 提 前 加 有 1 0 0 L 完 全 培 养 基 的 细 胞 板 孔 内，混 匀，吸 取 1 0 0 L 到 第 二 个 加 有 1 0 0 L 完 全 培 养 基的 细 胞 板 孔 内，依 次 倍 比 稀 释 到 第 八 个 孔。在 显 微 镜 下 观 察，将 约 有 1 0 0 个 细 胞 的 孔 内 细 胞 再 次 吸 出 用完 全 培 养 液 稀 释 至 1 0 m L，分 铺 于 一 块 提 前 铺 好 饲 养 细 胞 的 9 6 孔 板 内，每 孔 1 0 0 L，3 7 C O2培 养 箱 内 静置 培 养，此 过 程 称 之 为 亚 克 隆。将 倍 比 稀 释 最 后 一 孔 多 出 的 1 0 0 L 及 9 6 孔 板 剩 余 的 细 胞 移 取 至 加 有 饲 养细 胞 的 2 4 孔 板 内 进 行 扩 大 培 养。亚 克 隆 细 胞 培 养 至 5 天 左 右 进 行 半 换 液，7 天 左 右 进 行 全 换 液，取 上 清 进行 检 测，对 检 测 为 阳 性 的 细 胞 按 上 述 方 法 再 次 进 行 亚 克 隆 及 检 测。对 连 续 三 次 亚 克 检 测 为 阳 性 的 单 克 隆细 胞 进 行 定 株，同 时 将 扩 大 培 养 的 原 代 细 胞 及 时 冻 存。A.1.4.4 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 腹 水 的 制 备将 亚 克 隆 经 过 检 测 定 株 的 杂 交 瘤 细 胞 复 苏，扩 大 培 养。提 前 一 周 用 弗 氏 不 完 全 佐 剂 腹 腔 注 射 8 周 龄B A L B/c 小 鼠，0.5 m L/只，将 扩 大 培 养 处 于 对 数 生 长 期 的 杂 交 瘤 细 胞 离 心，去 掉 培 养 基，用 R P M I 1 6 4 0 不 完全 培 养 基 重 悬 后 腹 腔 注 射 小 鼠。待 小 鼠 腹 部 隆 起 时，抽 取 其 腹 水，离 心，去 除 沉 淀，上 清 冻 存 待 用。A.2 单 克 隆 抗 体 纯 化 及 验 证A.2.1 单 克 隆 抗 体 纯 化将 保 存 的 单 抗 腹 水 6 m L 置 于 p H 7.4 P B S 溶 液 中 透 析 过 夜，次 日 取 出，加 入 6 m L P B S 混 匀。将 P r o t e i n A胶 吸 至 纯 化 柱 内，将 柱 子 垂 直 固 定，打 开 柱 子 下 方 盖 子，待 液 体 流 尽，加 入 2 0 m L 双 蒸 水，待 水 流 尽 后，再 加 入 2 0 m L P B S 平 衡 柱 子。加 入 混 匀 的 腹 水，封 闭 柱 子，固 定 于 摇 床 上 轻 摇 3 0 m i n。打 开 柱 子 下 方 的 盖子，放 出 柱 中 的 液 体，加 入 2 0 m L 洗 脱 液，取 1 0 个 4 m L E P 管，每 管 内 预 先 加 入 1 0 0 L 1 M T r i s-C l（p H 9.0），每 管 收 集 2 m L，混 匀，4 暂 存。将 柱 子 用 单 蒸 水 洗 涤 后，加 入 2 0%乙 醇 4 保 存。将 收 集 的 样 品 S D S-P A G E电 泳 分 析 其 纯 化 效 果，见 图 1。A.2.2 单 克 隆 抗 体 W e s t e r n-B l o t 验 证将 超 离 纯 化 的 D T M U V 全 病 毒 取 5 0 L 加 上 1 2.5 L 5 S D S 变 性 B u f f e r 9 5 加 热 5 m i n，进 行 S D S-P A G E，电 泳 完 毕，取 出 凝 胶，6 0 v，6 0 m i n，在 T r i s-c l 和 甲 醇 混 合 溶 液 中 转 至 P V D F 膜 上，转 化 完 毕，将 膜 取 出，浸 泡 至 2%的 B S A-P B S 溶 液，4 过 夜 放 置。次 日 取 出，用 P B S-T 洗 涤 三 次，每 次 3 m i n，加 入 1:1 0 0 稀 释 的 纯D B 4 2/T X X X X-X X X X6化 单 抗，室 温 孵 育 1 h，洗 涤 三 次，加 入 1:2 0 0 0 稀 释 的 H R P 标 记 的 羊 抗 鼠 抗 体 溶 液，室 温 孵 育 1 h，洗 涤 三次，D A B 显 色 液 浸 泡 显 色，用 单 蒸 水 终 止 反 应，见 图 2。注：1,2,3,4 泳道分别为来源于不同时间段洗脱的纯化产物。图 1 纯 化 的 5 F 1 小 鼠 单 抗 腹 水 S D S-P A G E 电 泳 图注1：A：全病毒 S D S-P A G E；红色五角星示5 5 k D 处E 蛋白；注2：B：全病毒与单抗 W B 图；蓝色五角星表示杂交所示的7 0-1 0 0 k D 之间的蛋白条带；注3：M：蛋白 m a r k e r；S：D T M U V 全病毒样品。图 2 超 离 纯 化 的 D T M U V 全 病 毒 及 W e s t e r n 杂 交A.3 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 单 克 隆 抗 体称 取 1 0 m g H R P 粉 末 溶 于 1 m L 双 蒸 水 中，溶 解 后 混 匀，置 于 5 0 m L 小 烧 杯 中，加 入 1 m L 0.0 6 m o l/L 的 高 碘酸 钠 溶 液，轻 轻 转 动 容 器，混 匀，4 放 置 3 0 m i n。往 上 述 溶 液 中 加 入 1 m L 0.1 6 m o l/L 乙 二 醇，轻 轻 转 动容 器，混 匀，室 温 避 光 放 置 3 0 m i n，往 上 述 溶 液 中 加 入 1 0 m g 1 1 m g 纯 化 的 单 抗，轻 轻 转 动 混 匀，将 所 有溶 液 装 入 透 析 袋，置 于 碳 酸 盐 溶 液 中，4 透 析 过 夜，中 途 换 液 三 次。取 出 透 析 袋 中 液 体，加 入 0.4 m L5 m g/m L 的 硼 氢 化 钠 溶 液，4 静 置 2 h。往 上 述 溶 液 中 加 入 等 体 积 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 沉 淀 结 合 物，缓 慢 滴 加，同 时 在 磁 力 搅 拌 器 上 轻 轻 搅 拌，加 完 后 轻 轻 转 动 混 匀，4 静 置 3 0 m i n 后 4 3 0 0 0 r p m 离 心 1 5 m i n，弃 上 清。将 沉 淀 物 溶 于 适 量 的 0.0 2 M 的 P B 溶 液 中，装 入 透 析 袋，置 于 P B 中 平 衡 透 析 6 h-1 2 h，中 途 换 液 三 次，取 出透 析 袋 中 液 体，加 入 等 体 积 甘 油，分 装，-8 0 冻 存。D B 4 2/T X X X X-X X X X7A.4 纯 化 单 抗 及 酶 标 单 抗 的 蛋 白 浓 度 测 定以 最 终 稀 释 沉 淀 的 缓 冲 液 作 为 空 白 对 照，用 N a n d r o p C 2 0 0 0 测 定 仪 测 定 浓 度，根 据 P r o t e i n A 2 6 0/2 8 0软 件 分 别 测 定 纯 化 和 酶 标 单 抗 的 蛋 白 浓 度。纯 化 的 单 克 隆 抗 体 样 品 浓 度 为 2.3 9 2 m g/m L，H R P 标 记 的 单 克隆 抗 体 样 品 浓 度 为 2.5 6 m g/m L。D B 4 2/T X X X X-X X X X8A A附 录 B（资 料 性）对 照 品 的 制 备B.1 阴 性 对 照 品 的 制 备 及 检 验B.1.1 阴 性 对 照 品 的 制 备取 9 日 1 0 日 龄 S P F 鸡 胚，收 集 鸡 胚 尿 囊 液，1 0 0 0 0 r p m 离 心 5 m i n 弃 去 沉 淀，保 留 上 清，-2 0 条 件 下保 存。B.1.2 阴 性 对 照 品 的 检 验B.1.2.1 R N A 的 提 取 及 反 转 录取 0.2 m L 鸡 胚 尿 囊 液，1 2 0 0 0 r p m，3 m i n，将 上 清 移 入 2 m L 无 R N A 酶 E P 管 内，加 入 0.8 m L T r i z o l试 剂，轻 轻 混 匀，室 温 静 置 1 0 m i n，加 入 0.2 m L 氯 仿，剧 烈 振 摇 1 5 s，冰 浴 1 0 m i n，4 1 2 0 0 0 r p m 离心 1 5 m i n，将 上 清 移 入 新 的 E P 管 内，加 入 等 体 积 异 丙 醇，轻 轻 混 匀，室 温 静 置 1 0 m i n，4 1 2 0 0 0 r p m离 心 1 0 m i n，弃 去 上 清，在 E P 管 内 加 入 1 m L 乙 醇 轻 轻 混 匀，4 7 5 0 0 r p m 离 心 5 m i n 弃 去 上 清，室温 晾 干，加 入 1 5 L D E P C 水 溶 解，用 N a n o d r o p 浓 度 测 定 仪 测 定 其 浓 度 为 4 8.9 n g/L，-8 0 保 存 备用。提 取 的 R N A（1 2.5 L）、O l i g o（d T）（1 L）、A M V 反 转 录 酶（0.5 L）、1 0*A M V b u f f e r（2 L）、R R I（1 L）、R N a s e-f r e e-w a t e r（3 L）将 上 述 各 试 剂 轻 轻 混 匀（共 2 0 L），4 2 1 h，7 2 1 5 m i n取 出，短 暂 离 心 后 4 保 存。B.1.2.2 P C R 鉴 定根 据 G e n B a n k 登 录 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 基 因 组 N S 5 基 因 设 计 一 对 特 异 性 引 物，引 物 序 列 为：N S 5-F:5-G G G G A G G T G G T T T G G T T A G-3 N S 5-R:5-G T T C T G G G G C T T T G G T A T C-3 扩 增 片 段 大 小 为 4 9 8 b p。P C R 反 应 体 系：c D N A（2 L）、1 0 T r a n s B u f f e r（2.5 L）、T r a n s T a q D N A P o l y m e r a s e（0.5 L）、上、下 游 引 物（各 1 L），补 H2O 至 2 5 L。P C R 反 应 程 序：9 5 变 性 5 m i n 后 进 行 9 4 变 性 3 0 s，5 4 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 3 0 s 的 3 2 个 循 环，最 后 7 2 延 伸 1 0 m i n，保 存 于 4，在 0.5%的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳，在 4 9 8 b p 处 应 无 目 的 条 带。B.2 阳 性 对 照 品 的 制 备 及 检 验B.2.1 阴 性 对 照 品 的 制 备将 实 验 室 分 离、鉴 定 并 保 存 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 取 1 0 0 L 接 种 9 日 龄 1 0 日 龄 S P F 鸡 胚，置 于 3 7 孵 化 箱内 孵 化。剔 除 2 4 h 之 内 的 死 亡 鸡 胚，收 集 9 6 h 内 所 有 胚 的 尿 囊 液，1 0 0 0 0 r p m 离 心 5 m i n 弃 去 沉 淀，保 留 上 清，-2 0 条 件 下 保 存。D B 4 2/T X X X X-X X X X9B.2.2 阳 性 对 照 品 的 检 验B.2.2.1 R N A 的 提 取 及 反 转 录取 0.2 m L 鸡 胚 尿 囊 液，1 2 0 0 0 r p m，3 m i n，将 上 清 移 入 2 m L 无 R N A 酶 E P 管 内，加 入 0.8 m L T r i z o l 试 剂，轻 轻 混 匀，室 温 静 置 1 0 m i n，加 入 0.2 m L 氯 仿，剧 烈 振 摇 1 5 s，冰 浴 1 0 m i n，4 1 2 0 0 0 r p m 离 心 1 5 m i n，将上 清 移 入 新 的 E P 管 内，加 入 等 体 积 异 丙 醇，轻 轻 混 匀，室 温 静 置 1 0 m i n，4 1 2 0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n，弃 去上 清，在 E P 管 内 加 入 1 m L 乙 醇 轻 轻 混 匀，4 7 5 0 0 r p m 离 心 5 m i n 弃 去 上 清，室 温 晾 干，加 入 1 5 L D E P C水 溶 解，用 N a n o d r o p 浓 度 测 定 仪 测 定 其 浓 度 为 4 8.9 n g/L，-8 0 保 存 备 用。提 取 的 R N A（1 2.5 L）、O l i g o（d T）（1 L）、A M V 反 转 录 酶（0.5 L）、1 0*A M V b u f f e r（2 L）、R R I（1 L）、R N a s e-f r e e-w a t e r（3 L）将 上 述 各 试 剂 轻 轻 混 匀（2 0 L），4 2 1 h，7 2 1 5 m i n 取 出，短 暂 离 心 后 4 保 存。B.2.2.2 P C R 鉴 定根 据 G e n B a n k 登 录 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 基 因 组 N S 5 基 因 设 计 一 对 特 异 性 引 物，引 物 序 列 为：N S 5-F:5-G G G G A G G T G G T T T G G T T A G-3 N S 5-R:5-G T T C T G G G G C T T T G G T A T C-3 扩 增 片 段 大 小 为 4 9 8 b p。P C R 反 应 体 系：c D N A 2 L，1 0 T r a n s B u f f e r 2.5 L，T r a n s T a q D N A P o l y m e r a s e 0.5 L，上、下 游引 物 各 1 L，补 H2O 至 2 5 L。P C R 反 应 程 序：9 5 变 性 5 m i n 后 进 行 9 4 变 性 3 0 s，5 4 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 3 0 s 的 3 2 个 循 环，最 后 7 2 延 伸 1 0 m i n，保 存 于 4，在 0.5%的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳，在 4 9 8 b p 处 应 有 目 的 条 带。D B 4 2/T X X X X-X X X X1 0B B附 录 C（规 范 性）试 剂 的 配 制C.1 包 被 液碳 酸 钠（N a2C O3）1.5 9 g，碳 酸 氢 钠（N a H C O3）2.9 3 g，加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L，置 2 8 保 存 备 用。水 的 规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法。C.2 洗 涤 液氯 化 钠（N a C l）8 g，氯 化 钾（K C l）0.2 g，十 二 水 磷 酸 氢 二 钠（N a2H P O4）2.9 g，磷 酸 二 氢 钾（K H2P O4）0.2 g，T w e e n-2 0 0.5 m L，加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L，置 2 8 保 存 备 用。水 的 规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法。C.3 底 物 液，T M B 显 色 液。C.4 终 止 液氢 氟 酸 2 5 0 L，加 蒸 馏 水 至 1 0 0 m L。水 的 规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法。C.5 样 品 稀 释 液氯 化 钠（N a C l）8 g，氯 化 钾（K C l）0.2 g，十 二 水 磷 酸 氢 二 钠（N a2H P O4）2.9 g，磷 酸 二 氢 钾（K H2P O4）0.2 g，加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L，置 2 8 保 存 备 用。水 的 规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分 析 实 验 室 用 水 规 格和 试 验 方 法。C.6 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白（B S A）5 g，氯 化 钠（N a C l）8 g，氯 化 钾（K C l）0.2 g，十 二 水 磷 酸 氢 二 钠（N a2H P O4）2.9 g，磷 酸 二 氢 钾（K H 2 P O 4）0.2 g，硫 柳 汞 钠 0.2 g，加 蒸 馏 水 至 1 0 0 0 m L，置 2 8 保 存 备 用。水 的规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _