ICS 65.0 20.30 B 43 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 16822018 水牛胚胎质量检测技术规程 Detection p rocedures for q uality evaluation in embryo s of water b uffalo2018-03-25 发布 2018-04-25 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发布 DB 45/T 1 68 2 20 18 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语和定 义.1 4 抽样和胚 胎保存.1 5 检测环境.2 6 检测方法.2 7 评定结果.3 附录 A（规范 性附录）试剂、耗材和设备.4 附录 B（规范 性附录）冷冻胚胎解冻方法.6 附录 C（规范 性附录）胚胎图片示例.7 DB 45/T 1 68 2 20 18 II DB 45/T 1 68 2 20 18 III 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 200 9 给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区水牛研究所。本标准主要起草人：郑海英、尚江华、杨春艳、黄加祥、郑威、梁贤威、鄢胜飞、李孟琪、于农 淇、张秀芳、黄芬香。DB 45/T 1 68 2 20 18 1 水牛胚胎质量检测技术规程 1 范围 本标准规定了水牛胚胎质量检测术语与定义、抽样和胚胎保存、检测环境、检测方法与评定结果技 术规程。本标准适用于水牛体内或体外来源的新鲜胚胎和冷冻胚胎的质量检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 5 45 8 液氮生物容器 GB/T 1 80 88 出入境动物 检疫采样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 超低温保存 cr yo pr es erv at io n 经特殊方法处理的胚胎放置在19 6 的超低温度中，使其新陈代谢暂时停止，从而将胚胎进行长 期保存的一种方法。3.2 胚胎解冻 em br yo t ha win g 将冷冻保存的胚胎按一定的程序和方法在空气和水浴中解冻，并脱除冷冻保护剂，使胚胎恢复正常 的形态和新陈代谢的过程。3.3 胚胎体外培养 e mb ry o i n vi tr o cul tu re 在模拟体内子宫环境和条件下，胚胎在体外继续发育的过程。4 抽样和胚胎保存 4.1 抽样 应符合GB/T 18 08 8的要求。DB 45/T 1 68 2 20 18 2 4.2 胚胎保存 胚胎应保存在-1 96 的 液氮容器中，容器应符合GB/T 54 58 的规定。取放胚胎时，在空气中暴露时 间不能超过1 0 s。胚胎保 存期间，要定期检 查 容器中液氮 消 耗 情况，适 时 补充 液氮，确 保保存胚胎的 细 管 在液氮液 面以 下。4.3 信息记录 抽样时，应 详细记 录保存胚胎 细管上 标 记 的 完整信息。5 检测环境 洁净无菌 环境。6 检测方法 6.1 系谱资料 待 检胚胎应有 完整 的 系谱资料(适用 于体内胚胎和体外胚胎)。6.2 标识 保存胚胎的 细管 应有 明确 的标 记，标 记 内容应包括 品 种、公母 牛 编号、胚胎 数 量、胚胎发育 阶段、胚胎质量 级别、生产日期、生产单位 等，标 记上 的 字迹清晰、完整、准 确，并 做好 存放 记 录。6.3 试剂、耗材和设备 参见 附录A。6.4 胚胎质量检测方法 6.4.1 胚胎的形态学检测 借助 于体 视显微镜 对胚胎的发育 阶段 和 状况 进行形态 学观察。6.4.2 胚胎的体外发育能力评判 将胚胎置于3 8 39、5 C O 2 和10 0 最 大饱 和 湿 度的环境下 培养，并于 开始培养后 24 h 和4 8 h 分别观察 胚胎的存 活 和发育 情况。冷冻胚胎应按照程序要求进行解冻 后 检测，胚胎解冻程序 参见 附录B。6.5 胚胎质量检测内容 6.5.1 胚胎发育阶段 6.5.1.1 桑椹胚 受精后第 4 d 5 d 的胚胎，能 观察到球状 的 细胞团，分裂球 间 隙 不 明显，占据透明带 内 腔 的5 0 60。DB 45/T 1 68 2 20 18 3 6.5.1.2 致密桑椹胚 受精后第5 d 6 d的胚胎，细胞团变小，卵裂球之间界限难以分辨，细胞团与透明带之间空 隙明显增大，占透明带内腔的6 070。6.5.1.3 早期囊胚 受精后第6 d 7 d的胚胎，内细胞团的一部分出现囊胚腔，但难以分清内细胞团和滋养层，细胞团占透明带内腔的70 80。6.5.1.4 囊胚 受精后第6 d 8 d的胚胎，内细胞团和滋养层界限清晰，囊胚腔明显，细胞充满透明带内腔。6.5.1.5 扩张囊胚 受精后第7 d 9 d的胚胎，体积增至原来的1.2 1.5倍，与透 明带之间无空隙，囊胚腔明显扩 大，透明带变薄。6.5.1.6 孵化囊胚 囊胚腔继续扩大，透明带破裂，胚泡从透明带中脱出。6.5.2 胚胎质量分级 正常发育胚胎透明带完整，形态规则，色调均匀一致，透明度适中。根据形态学及发育程度划分胚 胎质量，分为A、B、C、D 四个等级（参考图片参见附录C）：A 级：胚胎的 发育阶段与预期的发育阶段一致。胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大 小均匀，结 构紧凑，色调和透明度适中，胚胎细胞团呈均匀对称的球形，透明带光滑完整，厚 度适中，不规则的细胞相对较少，变性细胞比例少于 10；B 级：胚胎的 发育阶段与预期的发育阶段基本一致。胚胎形态较完整，轮廓清晰，色调及细胞 密度良好，透明带光滑完整，厚度适中，存在一定数量大小和形状不规则的细胞或细胞团，有一定数量细胞的颜色明暗不一、密度不均匀，变性细胞比例为 10 20；C 级：胚胎的 发育阶段与预期的发育阶段不一致。胚胎形态不完整，轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞较多，变性细胞比例为 20 40；D级：胚胎的 发育 阶段与预期的发育阶段不一致，包 括 退化的胚胎、未受精卵或1-细胞 胚胎及 16-细胞胚胎以下的受精卵。内细胞团 有较多 碎 片、轮廓 不 清晰、结 构松 散，变 性 细胞比例高 于4 0，为 不可用胚胎。6.6 评定要求 每次评定应安排 2 名经胚胎生物技术培训的技术人员进行检测，独立评定，得出综合评定结果。若一次评定结果未能达成一致，则 另安排技术人员 2 名进行 二次评定，并综合两次评定结果，协商后进 行胚胎定级。评定结果应准确记录，资料存档备查。7 评定结果 胚胎的发育阶段为；级别为；在38 39、5 CO 2 和1 00 最大饱和湿度的CO 2 培养 箱中培养24 h(或4 8 h)，胚 胎由阶段发育到阶段。DB 45/T 1 68 2 20 18 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂、耗材和设备 A.1 主要试剂及要求 A.1.1 试剂名称 碳酸氢钠（NaH C O 3）、乙二 醇（(C H 2 OH)2,E G）、蔗糖、甘油、HEP ES、肝素、T C M 1 99、P B S（磷酸缓冲盐溶 液）、胎牛 血清（F B S）、牛 血清白蛋白（B S A）。A.1.2 试剂要求 所用的试剂除特殊规定外，均为分析纯及 其 以上纯 度的化 学 试剂，符合 组织细胞培养 要求。TC M 1 99、胎牛 血清等为推荐选 用胚胎 培养 测试的产 品。A.1.3 胚胎体外培养液 推荐 使用TC M 1 99（含 25 mM HE PE S 和0.26 mM Na H C O 3）+10 F B S。A.1.4 血清的灭活处理 新 购 的胎牛 血清，已 注 明灭活 处理的，用 0.45 m滤 器过 滤灭菌后，可 以直接 使用；未 注 明灭活 处理的，需 56 水浴 灭活 30 mi n，用 0.45 m滤 器过 滤灭菌后 使用。血清 经 灭活及 过 滤灭菌后，分装并于-2 0 或-8 0 超低温 冰箱 中长期保存备用。A.2 主要耗材 A.2.1 玻璃培养皿：20 mm。A.2.2 塑料培养皿：35 mm、6 0 mm。A.2.3 滤 器：0.22 m、0.4 5 m。A.2.4 移 液器（2 L，2 0 L，2 00 L，1 00 0 L）。A.2.5 移 液器 盒（2 L，2 0 L，20 0 L，1 00 0 L）。A.2.6 0.25 mL塑料 胚胎 麦管。A.2.7 胚胎 吸管。A.2.8 玻璃细管：5 mm。A.2.9 透明硅胶软管。A.2.10 脱 脂棉。A.2.11 纱布。A.2.12 封 口 膜。A.2.13 标 签纸。A.2.14 记号笔。A.2.15 一 次 性 乳胶 或 PE手套。DB 45/T 1 68 2 20 18 5 A.3 主要设备 A.3.1 体视显微镜(20)。A.3.2 CO 2 培养箱(38 39、5 C O 2 和1 00 最大饱和湿度)。A.3.3 冰箱或冰柜（-2 0 4）。A.3.4 高压灭菌器。A.3.5 超净工作台。A.3.6 恒温热台（3 9）。A.3.7 低温冰箱（-80）。A.3.8 电子分析天平（感量 0.01 m g）。A.3.9 移液器（2 L，2 0 L，2 00 L，1 00 0 L）。A.3.10 超声波清洗仪。A.3.11 电热鼓风干燥箱。A.3.12 双重蒸馏器。A.3.13 超纯水仪。A.3.14 液氮生物容器。A.3.15 酒精灯。DB 45/T 1 68 2 20 18 6 B B 附 录 B（规范性附录）冷冻胚胎解冻方法 B.1 甘油冷冻胚胎的解冻 B.1.1 解冻液的配制 分别 配制 含 6、3 和0 甘油 的0.1 m ol/L蔗糖P B S 胚胎解冻液，用0.22 m滤 器过 滤。B.1.2 胚胎解冻 从液氮 罐 中取 出 装 有胚 胎的 细管，室 温下空气浴1 0 s后 置 于35 37 水浴中，浸 浴 至 胚胎冷冻细管 内液体 彻底融 化。B.1.3 脱除甘油 用75 酒 精消 毒卫 生 棉球 擦干 细管，剪去 封 口 端，将胚胎 推 入 培养皿 中；将胚胎 依 次移 入 含 6、3 和0 甘油 的0.1 m ol/L蔗糖 胚胎 P B S 解冻液中，各 停 留 5 m in；最 后 用胚胎体外 培养 液 清 洗 3 次，即 可 进行 镜 检。B.2 乙二醇冷冻胚胎解冻 将胚胎 细管 空气浴1 0 s后 置于3 5 37 水浴中，浸 浴 至 胚胎 冷冻 细管 内液体 彻底融 化，用经 灭 菌消 毒 过的 卫 生 纸 擦干 细管，剪去 封 口 端，将胚胎 推 入 培养皿，用胚胎体外 培养 液 清 洗 3 次，镜 检。DB 45/T 1 68 2 20 18 7 C C 附 录 C（规范性附录）胚胎图片示例 C.1 桑椹胚胚胎质量示例 见图C.1。图C.1 A级 B 级 C 级 D 级 C.2 囊胚胚胎质量示例 见图C.2。图C.2 A 级 B 级 C 级 D 级 DB 45/T 1 68 2 20 18 8 C.3 不可用胚胎示例 C.3.1 未受精卵 见 图C.3。图C.3 未受精卵 C.3.2 变异胚胎 见 图C.4。图C.4 变异胚胎 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 水牛胚胎质量检测技术规程 DB45/T 1682 2018 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究