ICS 65.020.01 B 16 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 3987 2020 兰花细菌 性褐腐病 菌检疫鉴 定方法 Detection and identification of Erwinia cypripedii 2020-06-08 发布 2020-07-08 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3987 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由青 岛海 关提 出、归口并 组织 实施。本标准 起草 单位：青 岛海 关技术 中心、厦 门海 关技 术中心、烟 台海 关技 术中 心。本标准 主要 起草 人：厉艳、廖富 荣、静平、房 保海、邵秀 玲、封立 平、李金 庆。DB37/T 3987 2020 1 兰 花细菌 性褐腐病 菌检疫 鉴定方法 1 范围 本标准 规定 了兰 花细 菌性 褐腐病 菌的 分离 培养、生 理生化 特征 及分 子生 物学 等检测 鉴 定 方法。本标准 适用 于兰 花植 株中 兰花细 菌性 褐腐 病菌 的检 测鉴定 及该 病害 的田 间调 查与监 测。2 兰花细 菌性 褐腐 病菌 基本 信息 中文名：兰 花细 菌性 褐腐 病菌，杓兰 欧文 氏菌 学名：Erwinia cypripedii（hori）Bergey et al.1923 异名：Pectobacterium cypripedii（hori）Brenner et al.1973 Pantoea cypripedii 英文名：Bacterial soft rot of orchid 分类地 位：细菌 域Bacteria，变 形菌 门Proteobacteria，-变 形菌 纲Gammaproteobacteria，肠杆菌目Enterobacteriales，肠杆菌 科Enterobacteriaceae，欧文 氏菌 属Erwinia。传播途 径：远 距离 传播 主 要靠带 菌种 苗，近 距离 传 播主要 借助 叶面 浇水、喷 雾或施 肥而 将病 原菌 散播至健 康植 株上，通 过叶 片伤口 及自 然孔 口侵 染，造成二 次感 染。3 原理 根据兰 花细菌 性褐 腐病菌 的特异 性DNA 序列进 行分 子 生物学 检测；根据 兰花细 菌性褐 腐病菌 的培 养性状、生物 学特 性、寄主 范围及 危害 症状 等对 病原 菌进行 分离 培养 及致 病性 测定。4 仪器设 备和 主要 试剂 4.1 仪器设 备及 用具 PCR 仪、电泳 仪、凝胶 成像 系统、Biolog 仪、显微 镜、高速 冷冻 离心 机、恒 温 培养箱、超 净工 作台、高压灭 菌器、水 浴锅、台 式小型 离心 机、超低 温冰 箱、常 规冰 箱、旋涡 振荡 器、微 量可 调加 样器、剪 刀、解剖刀、玻 璃棒、接 种环、镊子、培 养皿、酒 精灯、三角 烧瓶、量 筒、离心 管、滤 纸等。4.2 主要试 剂 除非另 有说明，在 分析中 仅使用 分析纯 试剂 和去离 子水。PCR 反 应体系 用双 蒸 水。商 品化试 剂参 见其使用 说明。NA 培养 基配 制方 法:蛋白 胨10 g，牛 肉浸 膏3 g，氯 化钠5 g，琼脂17 g，调 节pH 至7.2，用蒸 馏水补充至1 000 mL，121 高压灭 菌15 min。5 田间观 察检 测 DB37/T 3987 2020 2 参照附 录A中 的症状 描述 观 察植株 是否有 兰花 细菌性 褐腐病 的典型 症状，对出 现典型 症状或 可疑 症状的植 株进 行拍 照记 录，并采集 表现 症状 植株 送实 验室进 行检 测鉴 定，田间 无症状 植株 可随 机采 样。6 实验室 检测 6.1 样品制 备 选择有 褐腐 症状 的植 株，用脱脂 棉蘸 取75%乙 醇擦 拭病部 表面 进行 表面 消毒，用 灭菌 剪刀 剪取 新 鲜病叶上 的病健 交界 部位（无症状 样品，随机 选取叶 片）组 织置于 培养 皿内，用75%的乙醇（或1%的次氯酸钠）表面 消毒50 s60 s，无 菌水 清洗3 次，然 后将其 移至灭 菌培 养皿中，加适 量无菌 水，用灭 菌玻棒或 剪刀 捣碎 组织，静 置15 min 20 min 后，即 制成组 织悬 浮液，用 于分 离培养 及分 子生 物 学 检 测。6.2 分子生 物检 测 6.2.1 模板制 备 按照6.1 的 方法 制备 成样 品 悬浮液 后，直接 用商 业化 植 物基因 组DNA 提 取试 剂盒 按 照操作 说明 提取 样品总DNA，-20 保 存备 用。对于分 离培 养得 到的 疑似 菌株，可直 接或 经裂 解处 理 后（97 沸水 浴10 min；12 000 g 离心10 min，取上清 液，-20 保 存）作为分 子生 物学 检测 反应 模板。6.2.2 常规PCR 检测 对于叶 片等 植株 样品，以 已知 带 菌的 兰花 植株 组织 作阳性 对照（若无 已知 带 菌材料，可用 模拟 带菌方式代 替），以 健康 的兰 花 植株组 织作 阴性 对照，以 双蒸水 代替 模板 作为 空白 对照，对待 测样 品进 行PCR凝胶电 泳检 测。对 于纯 培 养菌株，以E.cypripedii 标准菌 株作 阳性 对照，用 非E.cypripedii 的植 物细 菌作阴性 对照，以双 蒸水代 替模板 作为空 白对 照，对 待测样 品进行PCR凝 胶电 泳 检测，具体检 测步 骤见 附录B。6.3 分离培 养鉴 定 按照6.1 的 方法 制备 成组 织 悬浮液 后，用灭 菌接 种环 蘸取悬 浮液 在NA 培养 基上 划线分 离，28 恒 温培养24 h 后 开始 观察，挑 取可疑 单菌 落进 行纯 化，转接2 次3 次，随后 进行 致病性 测定、BIOLOG 鉴定、分子生 物学 鉴定。6.4 BIOLOG 鉴定 利用BIOLOG 自动 微生 物鉴 定系统 对分 离纯 化的 菌株 进行鉴 定，按照 说明 书进 行操作 及结 果判 定。6.5 致病性 测定 如果有 争议 或者 有必 要需 按以下 步骤 对分 离纯 化的 菌株进 行致 病性 测定。将 待 测菌株 在NA 培养 基 上培养24 h 左 右，用无 菌水 配成108 CFU/mL 左右 的细 菌 悬浮 液，用针 刺法 接种 至健康 兰花 苗叶 片上28 保湿培 养，接种48 h 后开 始，每 隔24 h 观 察，是否 出现附 录A 中所 描述 的症 状。7 结果判 定 DB37/T 3987 2020 3 对于有 典型 症状 植株 样 品，分 子生 物学 检测 结果 为 阳性，即 判定 为检 出兰 花 细菌性 褐腐 病菌。无症状植株 样品，分子 生物 学 检测结 果阳 性，且 分离 培 养鉴定 或Biolog 鉴定 为阳 性，可判 定检 出兰 花细 菌 性褐腐病 菌。8 样品及 检测 结果 保存 8.1 样品及 菌种 保存 样品经 登记 和经 手人 签字 后妥善 保存。对 检出 兰花 细菌性 褐腐 病菌 的样 品应 保存于4 冰箱 中，以备复核。该 类样 品保 存期 满后应 经高 压灭 菌后 方可 处理。从检 测样 品中 分离 并鉴定 为兰 花细 菌 性 褐 腐 病菌的菌 株，应妥 善保 存。可采用 甘油 冷冻 保存 或冻 干保存。对 不需 要长 期保 存的菌 株应 及时 灭 菌 处 理。8.2 结果记 录与 资料 保存 完整的 实验 记 录 应包 括：样品来 源、种类、时间，检测时 间、地点、方法 和 结果等，并 要有 实验 人员和审 核人 员的 签字。现 场检疫 发现 的可 疑症 状、培养基 上的 菌落 特征 和人 工接种 的典 型症 状 等 应 及 时拍照保 存，PCR 凝胶 电泳 检 测需有 电泳 结果 照片。DB37/T 3987 2020 4 A A 附 录 A（资料 性附 录）兰花细 菌性 褐腐 病菌 相关 资料 A.1 症状 病菌主 要侵 染植 株或 叶片，病 菌若 在叶 片中 部为 害 则形成 卵圆 形水 淹状 黄色 斑点，后 转褐 色；若 从叶生长 点侵 入则 地上 部干 缩枯死。感 染初 期在 叶上 出 现软的、水 渍状 的小 斑点，继而发 展成 轮廓 清晰 的、褐色或 黑色 的凹 陷斑 点，淡褐色 油浸 状，并扩 展到 茎和生 长点（见 图1）。在 蝶兰中，此 斑点 为水 疱状，扩展并 联合 成片，外 围具 黄色或 浅绿 色的 晕圈；在 兜兰中，则 斑点 呈水 渍状 而柔软。此 病发 展 迅 速，会使整个 植株 死亡。高 温高 湿条件 下易 发病，相 对湿 度高于80%时，发病 重。图A.1 E.cypripedii 在大 花惠 兰 叶片中 部为 害症 状 图A.2 E.cypripedii 接种 蝴蝶 兰 幼苗 的 为害 症状 A.2 地理分 布 南非、日本、澳 大利 亚、美国、中国 台湾、韩 国。A.3 寄主植 物 DB37/T 3987 2020 5 仙人指甲 兰（Aeridis japonium）、杓兰 属(Cypripedium spp.)、兜兰属(Paphiopedilum)、蝶兰属(phalaenopsis)和 番木 瓜(Carica papaya)、大 花 蕙兰（Cymbidium）等。A.4 病原菌 形态 及理 化特 征 病原菌 菌体 杆状，两 端钝 圆，大 小为（0.5 1）m x（1 3）m，周 生鞭 毛。为革兰 氏阴性 菌，兼性厌 氧，最 适生长 温度 为27 30，37 能 生长，氧化酶 阴性、过氧 化氢酶阳 性，能利 用海 藻糖、麦芽 糖、蜜二 糖、纤维 二糖、不能 从乳 糖、棉子 糖产酸，不 能液 化 明 胶，不产生吲 哚，不产3-羟 基丁 酮。病 原菌 在NA 培养 基上 单菌落 表现 为淡 黄色、圆 形、表 面突 起、边缘 整 齐，光滑不透明。Erwinia 属 内 在 兰 花 上 引 起 腐 烂 症 状 的 细 菌 共 有 三 个 近 似 种，分 别 是E.cypripedii、E.chrysanthemi、E.carotovora，三 个近 似种 的理 化 特征比 较见 表A.1。表A.1 E.cypripedii、E.chrysanthemi、E.carotovora 三 个种的 理化 特征 比较 测试项目 Erwinia 属内三个近似种 E.cypripedii E.chrysanthemi E.carotovora 革兰氏染色（24 h）-吲哚产生-+-半固体琼脂-+苯基丙氨酸脱氨酶（24 h）+-明胶水解（22）-+己六醇-乳糖-d+麦芽糖+-d 棉子糖-+海藻糖+-+脂肪酶-+-接触酶反应（24 h）+注：-：0%10%阳性；d：26%75%阳性；+：90%100%阳性 DB37/T 3987 2020 6 B B 附 录 B（规范 性附 录）兰花细 菌性 褐腐 病 菌PCR 特异性 扩增 检测 方法 B.1 检测引 物 EcUP：5-TCAACGCCAAGCCGATTTCT-3 EcNP：5-ACGAATGAACCGTCGTCGGC-3 B.2 PCR 反 应体 系及 条件 25 L PCR 反应 体系：2PCR 预 混液 12.5 L，引 物10 mol/L 各1 L，DNA 模板2.0 L，补充超纯 水至25 L。PCR 反 应条 件：98/2 min；98，10 s；59.4，10 s；72，10 s，35个 循环；延 伸：72/3 min；4 保 存。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。B.3 琼脂糖 凝胶 电泳 PCR 扩 增产 物在1.5%琼脂 糖凝胶 上进 行电 泳。电 泳 结束后 在凝 胶成 像仪 的紫 外透射 光下 观察 是否 扩增出预 期的DNA 条带，并 拍 摄记录。扩 增产 物片 段大 小为420 bp。B.4 结果判 断 PCR 扩 增产 物在1.5%琼脂 糖凝胶 上进 行电 泳检 测。待测样 品、阳性 对照 均出 现约420 bp 条带、而 阴性对照 和空白 对照 均未出 现相应 条带，PCR 扩 增结 果 判定为 阳性；待测 样品、阴性对 照和空 白对 照均 未出现420 bp 条带，仅 阳性 对照出 现420 bp 条带，PCR 扩增结 果判 定为 阴性。DB37/T 3987 2020 7 参 考 文 献 1 任 欣正.植 物病 原细 菌 的分类 和鉴 定M.北 京：中国农 业出 版社，1994.2 Magorzata Waleron,Krzysztof Waleron,Anna J.Podhajska and Ewa ojkowska.Genotyping of bacteria belonging to the former Erwinia genus by PCR-RFLP analysis of a recA gene fragment.Printed in Great BritainJ.Microbiology,2002,148:583 595.3 S.Al ab,T.Naglic,M.Tusek-Znidaric,M.Peterkac,M.Ravnikarac and T.Dreoac*.Putative new species of the genus Dickeya as major soft rot pathogens in Phalaenopsis orchid productionJ.Plant Pathology,2017,66:1357 1368.4 Cating,R.A.,Hoy,M.A.,and Palmateer,A.J.2012.A comparison of standard and high-fidelity PCR:Evaluating quantification and detection of pathogen DNA in the presence of orchid host tissueJ.Plant Disease,2012,96:480-485._