ICS 65.0 20.20 B 16 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 21722020 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 Method of PCR method for detection of sugarcane smut 2020-10-29 发布 2020-11-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 DB 45/T 2 17 2 20 20 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语和定 义.1 4 缩略语.1 5 原理.2 6 材料和试 剂.2 7 仪器和设 备.3 8 引物.3 9 操作步骤.3 10 结果判 定.4 附录 A（资料 性）样品检测电泳图.5 DB 45/T 2 17 2 20 20 III 前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 20标准化工作导则 第1部分：标 准化文件的 结构和起草 规则的规 定 起草。本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西博测检测技术服务有限公司、广西吉锐安全技 术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。本文件主要起草人：梁俊、苏丽梅、刘守廷、龙智翔、黄易勤、黄小娟、刘月东、刘巧频、杨振 媚、黄芳、朱玉连、韦秀兰。DB 45/T 2 17 2 20 20 1 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 1 范围 本文件规定了甘蔗黑穗病的PC R检测 方法。本文件适用于甘蔗组培苗、种苗、种茎及大田植株黑穗病菌的分子检测及判定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB/T 6 68 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB 1 94 89 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 甘蔗黑穗病 甘蔗黑穗病是一种普遍存在于大多数植蔗国家和地区的主要甘蔗病病害，病原菌是真菌中的担子菌 门黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌，甘蔗黑穗病借气流、雨水、灌溉水、人事活动等在田间进行传播扩散，浸染 甘蔗芽与分蘖，产生一条黑色穗状物，造成甘蔗产量和含糖量大幅降低。3.2 聚合酶链式反应（P CR）PCR反应（Pol ym er se C ha in R ea ct io n,聚合酶链式反应）是 在变性、退火、延伸三 个温度下，利 用单链寡核苷酸引物对特异DN A片段 进行体外快速扩增，在短时间内使目的片段的扩增量达到数千万倍，从极微量的DN A起始，扩增 出g级的PC R 产物。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。PC R：聚合酶 链式反应（P ol ym er as e Cha in R ea ct i on）；DN A：脱氧核 糖核酸（D eox yr ib onuc lei c ac id）；dN TP：脱氧 核糖核苷三磷酸（D eo xy-ri bo nu cl eos id e tr ip hos ph at e）。DB 45/T 2 17 2 20 20 2 5 原理 甘蔗黑穗病 病原菌 产 生 孢 子，分 布 在甘蔗植株 内 外，通过 提 取 甘蔗黑 穗病 孢 子的 DN A，设 计特 定引 物，利 用PC R 检测技术对甘蔗黑穗病 DN A 进行体外 扩增 检测，可 得到 准 确 的 鉴 定结果。6 材料和试剂 除另 有 说明外，本文件中 使 用分析 纯（含）以上 试剂，用水 符合 GB/T 6 68 2规定的 二级 水，涉 及P CR 用水要求 达到 一 级 水 指 标。6.1 试剂 6.1.1 三羟甲基氨基甲烷（C 4 H 11 NO 3）：纯度 99%。6.1.2 乙二胺四乙酸二钠（ED TA 2 Na）：纯度 99.0%。6.1.3 硼酸（H 3 B O 3）：=1.43 g/cm，含量 99.5%。6.1.4 十六烷基三甲基溴 化 铵（CT AB）：=1.32 g/mL，纯度 9 9.0%。6.1.5 氯 化 钠（Na C l）：=2.16 5 g/cm，含量 99.5%。6.1.6 琼脂 糖。6.1.7 G el-R e d 核酸 染 料。6.1.8 液氮（N 2）：=0.81 g/cm。6.1.9 三氯甲烷（C H C l 3）：=1.50 g/cm。6.1.10 无 水 乙醇（C H 3 C H 2 OH）：=0.79 g/cm，含量 99.7%。6.1.11 DN A 分子 量 标准（DN A ma rk er）：可 以清楚 区分 1 00 bp 60 0 bp 的 DN A 片段。6.1.12 2 T aq P lu s P CR 预混 试 剂：0.1 U/L T aq P lu s P ol ym er as e、5 00 M dN TP ea ch、2 0 mM T ri s-H C l(pH=8.3)、1 00 mM K C l、3 mM Mg C l 2、稳 定剂、增强 剂。6.2 试剂配制 6.2.1 5 TBE 缓冲液 称取 5.4 g三 羟甲基氨基甲烷（6.1.1）、0.3 7 2 g 乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）和2.7 5 g硼 酸（6.1.3）溶 于70 mL纯 水中，定容 至 10 0 mL，在 10 3.4 k P a（12 1）条件 下 灭 菌20 mi n。6.2.2 0.5 TBE 缓冲液 量取 10 0 mL 浓度 5 TB E缓 冲液（6.2.1）于 烧杯 中，加 人90 0 mL纯 水 混匀。6.2.3 C TA B 提取溶液 称取 4 g十六 烷基三甲基溴 化 铵（6.1.4）、16.38 g氯 化 钠（6.1.5）、1.21 g三羟 甲基氨基甲烷（6.1.1）、1.49 g乙二胺 四乙酸二钠（6.1.2）溶 于70 mL纯 水，定容 至 20 0 mL，在 10 3.4 k P a（1 21）条件下 灭 菌2 0 mi n。6.2.4 无菌纯水 纯 水在10 3.4 k P a（1 21）条件下 灭 菌20 mi n。6.2.5 1%琼脂糖凝胶 DB 45/T 2 17 2 20 20 3 称取1 g琼脂 糖（6.1.6）溶于10 0 mL 的0.5 TB E缓 冲液（6.2.2），适当加热融化后加入10 L Gel-Red核酸染料（6.1.7），冷却 至 60倒入插好梳子的制胶槽中，冷却凝固。7 仪器和设备 7.1 电子天平：精确至 0.1 mg。7.2 恒温水浴锅。7.3 高速冷冻离心机：最高 15 00 0 rp m。7.4 PC R 扩增仪。7.5 水平电泳系统。7.6 凝胶成像系统。8 引物 正向引 物：5-CG CT CT GGT TC AT CA AC G-3，反向 引 物：5-T GCT GT CG AT GG AAG GT GT-3，预期 扩增片段大小为42 0 bp。9 操作步骤 9.1 样品 采集或送检的甘蔗青叶片做好标识，于-18 冰 箱中保存备用。9.2 D NA 的提取 取9.1中适量 甘蔗叶片用自 来水冲洗 干净，再用 纯水冲洗两 遍，自然晾 干后用不锈 钢剪刀剪碎 放入 研钵中，加入液氮（6.1.8）研 磨成粉 末状，分取10 0 mg 放入 1.5 mL 离心管中，加入75 0 L C TAB 提 取溶液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65 水浴45 min 60 mi n，期 间 每隔15 mi n颠倒离心 管混匀；加入50 0 L的三氯甲 烷（6.1.9），颠倒混匀，12 00 0 rp m 离心3 mi n，转移上清液约0.5 mL至新 离心管中，加入 等体积（0.5 mL）约4 的无水乙醇（6.1.10），颠倒混匀，于-18 冰 箱中静置1 h，12 00 0 rp m 离心3 mi n，去上清，室温下干燥至乙醇挥发完全；加入50 L无菌 纯水（6.2.4）于4 条件 下保存备用。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。9.3 P CR 扩增 9.3.1 P CR 反应体系 PC R反应体系 见表1。表1 P CR 反应体系 试剂 终浓度 体积 无菌纯水-6.5 L 2Taq Plus PCR预混试剂 1 12.5 L 10 mol/L正向引物 1.0 mol/L 2.5 L 10 mol/L反向引物 1.0 mol/L 2.5 L 25 ng/L DNA模板 1.0 ng/L 1.0 L 总体积-25.0 L DB 45/T 2 17 2 20 20 4 9.3.2 P CR 反应程序 预变 性94，4 mi n；9 4 变 性30 s，5 5 退火 30 s，72 延伸 1 mi n，3 5 次循 环；延伸反 应72，1 0 mi n。9.3.3 P CR 产物电泳检测 取 2.5 L 的PC R 产 物，在1%琼脂 糖 凝胶（6.2.5）中 进行 电泳检 测，其中一 个 泳 道加入D N A分子 量 标 准(6.1.11)。在电 压梯度为 1 V/cm 5 V/cm 条件下电泳，2 T aq P lu s P C R 预混 试剂（6.1.1 2）的 蓝 色 指 示带 到达胶 板 2/3 处（约 40 mi n）后，可结 束 电泳。9.3.4 凝胶成像分析 电泳结 束 后，将 1%琼脂 糖 凝胶（6.2.5）置 于 凝胶 成 像 仪 上 成 像，根据 DN A分子 量 标准(6.1.11)判定 扩增 条 带 的大小。1 0 结果判定 1 0.1 有效性判定 以灭 菌 纯 水 为 空白 对照，以 感 染 甘 蔗黑穗病病 株 或 病原菌 的 DN A 为 阳 性 对照，以 甘蔗 无 病种苗 基 因 组的 DN A提 取液 为 阴 性对照。空白 对照的 扩增产 物 经 电泳检测应 无 条 带 出 现。阳 性对照的 扩增产 物出 现 特异 性条 带，阴 性对照的 扩增产 物 经 电泳检测 均没 有 预 期大小的 目 的条 带。上 述空白、阳 性、阴 性对 照 同 时 成 立 则 表明 试验有 效，否 则试验 无 效。对试验 无 效，需 再次 重复 试验 确 认。1 0.2 阳性判定 如 果 阳 性对照和检测样品中 都 出 现 目 的 扩增 条 带（420 bp），而 阴 性对照、空白 对照 均 不出 现 该条 带，该样品判 为 阳 性。1 0.3 阴性判定 如 果 阳 性对照出 现 目 的 扩增 条 带（42 0 bp），而 阴 性对照、空白 对照及检测样品中 均 不出 现 该条 带，则该样品判 为 阴 性。DB 45/T 2 17 2 20 20 5 附 录 A（资料性）样品检测电泳图 样品检测电泳图见图 A.1。注：MMarker I；空空白对照；阴阴性对照；阳阳性对照；1疑似黑穗病甘蔗叶样品 1；2与样品 1 同株甘蔗 青叶样品 2；3疑似黑穗病甘蔗叶样品 3；4与样品 3 同株甘蔗 青叶样品 4；5甘蔗青叶样品 5；6甘蔗青叶样品 6；7甘蔗组培苗样品 7；8甘蔗组培苗样品 8。图 A.1 样品检测电泳图 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 甘蔗黑穗病的鉴定方法 PCR 法 DB 45/T 2172 2020 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究