I C S 6 5.0 2 0.2 0B 2 1DB3301浙 江 省 杭 州 市 地 方 标 准D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 8甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 技 术 规 程2 0 1 8-0 6-2 0 发 布 2 0 1 8-0 6-2 0 实 施杭 州 市 质 量 技 术 监 督 局发 布D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 8I前 言本 标 准 按 照 G B/T 1.1 2 0 0 9 给 出 的 规 则 起 草。本 标 准 由 杭 州 市 农 业 局 提 出 并 归 口。本 标 准 起 草 单 位：杭 州 市 农 业 科 学 研 究 院、建 德 市 种 子 管 理 站、余 杭 区 农 业 技 术 推 广 中 心、淳 安 县农 业 技 术 推 广 中 心、临 安 区 农 林 技 术 推 广 中 心、浙 江 大 学。本 标 准 主 要 起 草 人：石 江、赵 琳、严 百 元、方 文 英、余 建 忠、骆 乐 谈、朱 月 清、孙 钟 毓、马 华 升。D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 81甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 甘 薯 脱 毒 种 苗 的 术 语 和 定 义、生 产 技 术、控 制 和 淘 汰 的 病 虫 害、病 虫 害 防 治、抽 样、扩 繁 苗 的 检 测、质 量 要 求 和 收 获。本 标 准 适 用 于 甘 薯 脱 毒 种 苗 繁 育、生 产 和 质 量 管 控。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B 7 4 1 3 甘 薯 种 苗 产 地 检 疫 规 程N Y/T 4 0 2 脱 毒 甘 薯 种 薯(苗)病 毒 检 测 技 术 规 程N Y/T 1 2 0 0 甘 薯 脱 毒 种 薯3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准。3.1脱 毒 组 培 苗应 用 茎 尖 分 生 组 织 培 养 技 术 获 得，经 检 测 确 认 不 带 甘 薯 羽 状 斑 驳 病 毒（S P F M V）、甘 薯 褪 绿 斑 病 毒（S P C F V）、甘 薯 病 毒 G（S P V G）、甘 薯 病 毒 2（S P V 2）、甘 薯 褪 绿 矮 缩 病 毒（S P C S V）的 组 培 苗。3.2脱 毒 种 苗在 有 保 护 措 施 的 基 质 中 用 脱 毒 组 培 苗 扩 繁 后 的 种 苗，在 本 规 范 中，包 括 初 级 至 四 级 繁 育 的 脱 毒 种 苗。4 生 产 技 术4.1 基 地 选 择应 选 择 周 边 5 0 0 m 内 无 村 庄，无 甘 薯 及 旋 花 科、茄 科、葫 芦 科 作 物 种 植，无 检 疫 性 病 虫 害 发 生 的 区域，选 用 背 风 向 阳、排 灌 方 便、前 作 非 以 上 作 物 种 植 及 有 隔 离 条 件 的 地 块，建 立 塑 料 大 棚，大 棚 外 完 全覆 盖 6 0 目 尼 龙 网，其 中 入 口 处 设 拉 链，方 便 人 员 进 出。4.2 育 苗 基 质根 据 条 件 选 用 商 用 育 苗 基 质。4.3 基 质 槽 建 立 与 基 质 铺 设D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 82在 保 护 大 棚 内，按 基 质 槽 宽 8 0 c m，操 作 道 宽 4 0 c m，建 立 基 质 槽，槽 底 用 约 1 0 c m 细 石 子 与 土 壤 隔离，基 质 铺 设 厚 度 约 2 0 c m。移 栽 前 1 天 浇 水 至 基 质 含 水 量 7 0%左 右。4.4 基 质 消 毒脱 毒 组 培 苗 移 栽 前 4 0 天，密 闭 大 棚，用 二 氧 化 氯 土 壤 消 毒 剂（2 k g/6 6 7 m2）通 过 喷 灌 或 滴 灌 对 基质 进 行 消 毒，直 到 基 质 底 层 完 全 湿 润 后 关 闭 阀 门，大 棚 密 闭 消 毒 7 天，随 后 通 风 排 除 残 留 氯 气。4.5 种 性 鉴 定将 脱 毒 苗 种 植 于 防 虫 网 室 内，每 株 系 3 株，对 照 原 品 种 的 特 征 特 性 及 生 产 力 鉴 定，剔 除 变 异 株 系 和混 杂 株 系，选 用 生 产 力 强 的 株 系 进 行 扩 大 繁 殖。4.6 脱 毒 种 苗 繁 育4.6.1 初 级 脱 毒 种 苗 繁 育大 棚 基 质 槽 加 设 小 拱 棚，当 小 拱 棚 内 温 度 稳 定 在 2 0 以 上 时，选 取 植 株 长 势 好、经 鉴 定 无 病 毒 携 带的 脱 毒 组 培 苗，洗 去 根 部 培 养 基 后 即 刻 移 栽 至 大 棚，基 质 槽 内 密 度 为 2 0 c m 2 0 c m。边 移 栽 边 浇 水 活 苗，并 遮 荫 3 天。注 意 大 棚、小 拱 棚 内 通 风 管 理，保 持 苗 生 长 温 度 在 2 5-3 0，当 大 棚 内 温 度 稳 定 在 2 0 以 上时，拆 掉 小 拱 棚。根 据 基 质 类 型、种 苗 生 长 情 况 对 其 进 行 肥 水 管 理。4.6.2 次 级 脱 毒 种 苗 繁 育当 初 级 脱 毒 种 苗 生 长 至 1 0 节 以 上，以 每 2 节 作 1 株 剪 取 种 苗，母 株 留 1 2 个 节 位，用 作 次 级 脱 毒 种 苗生 产。剪 取 的 种 苗 立 即 在 次 级 脱 毒 种 苗 繁 育 大 棚 内 移 栽，在 基 质 槽 内 脱 毒 组 培 苗 移 栽 密 度 约 为 4 0 c m 1 0c m。管 理 同 4.6.14.6.3 三 级 脱 毒 种 苗 繁 育当 次 级 脱 毒 种 苗 生 长 总 节 数 至 2 0 节 以 上 时，按 照 4.6.2 的 方 法 繁 育 三 级 脱 毒 种 苗。4.6.4 四 级 脱 毒 种 苗 繁 育参 照 4.6.3 三 级 脱 毒 种 苗 繁 育 的 方 法。5 控 制 和 淘 汰 的 病 虫 害5.1 控 制 的 病 虫 害通 过 控 制 病 害 的 发 生 程 度 以 达 到 脱 毒 种 苗 质 量 要 求 的 病 害:a)甘 薯 羽 状 斑 驳 病 毒（s w e e t p o t a t o f e a t h e r y m o t t l e v i r u s,S P F M V）；b)甘 薯 褪 绿 斑 病 毒（s w e e t p o t a t o c h l o r o t i c f l e c k s v i r u s,S P C F V）；c)甘 薯 病 毒 G（s w e e t p o t a t o v i r u s G,S P V G）；d)甘 薯 病 毒 2（s w e e t p o t a t o v i r u s 2,S P V 2）；e)甘 薯 褪 绿 矮 缩 病 毒（s w e e t p o t a t o c h l o r o t i c s t u n t v i r u s,S P C S V）；f)黑 斑 病（B l a c k r o t，病 原 C e r a t o c y s t i s f i m b r i a t a E L L.H a l s t）；g)疮 痂 病（S c a b,病 原 S p h a c e l o m a b a t a t a s S a w a d a）；h)蔓 割 病 S t e m r o t,F u s a r i u m w i l t；病 原 F u s a r i u m o x y s p o r u m f.s p.b a t a t a s(W o l l e n w e b e r)S n y d e r e t H a n s e n；D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 83i)茎 线 虫 病（S t e m n e m a t o d e,B r o w n r i n g；病 原 D i t y l e n c h u s d e s t r u c t o r T h o r n e）。5.2 淘 汰 的 病 虫 害不 能 在 达 到 质 量 要 求 的 脱 毒 种 苗 上 发 生 的 病 虫 害：a)根 结 线 虫 病 R o o t-k n o t n e m a t o d e，病 原 M e l o i d o g y n e i n c o g n i t a(K o f o i d W h i t e)C h i t w o o d；b)细 菌 性 萎 蔫 病（甘 薯 瘟）（B a c t e r i a l w i l t,病 原 P s e u d o m o n a s s o l a n a c e a r u m E.F.S m.）；c)根 腐 病 R o o t r o t,病 原 F u s a r i u m s o l a n i(M a r t.)S a c c.f.s p.b a t a t a s M c C l u r e；d)甘 薯 小 象 甲（蚁 象）W e e v i l,C y l a s.f o r m i c a r i u s(F a b r i c i u s)；e)茎 腐 病（b a c t e r i a l s t e m a n d r o o t r o t；病 原 E r w i n i a c A/y s a n f A m i）。6 病 虫 害 防 治6.1 主 要 病 虫 害主 要 病 虫 害 有 甘 薯 黑 斑 病、根 腐 病、病 毒 病、蚜 虫、地 老 虎、蛴 螬 等。6.2 防 治 原 则按 照“预 防 为 主，综 合 防 治”的 方 针，坚 持 以“农 业 防 治、物 理 防 治 和 生 物 防 治 为 主，化 学 防 治 为 辅”的 无 害 化 治 理 原 则。6.3 农 业 防 治保 持 防 虫 网 的 完 整，加 强 操 作 人 员 进 入 卫 生 与 进 出 管 理，及 时 关 闭 防 虫 网，合 理 调 节 环 境 因 子、改善 栽 培 条 件、优 化 水 肥 管 理，创 造 有 利 于 甘 薯 生 长 发 育 而 不 利 于 病 害 发 生 的 环 境 条 件。6.4 物 理 防 治采 用 杀 虫 灯、黄 板 以 及 性 诱 剂 诱 杀 害 虫。6.5 生 物 防 治释 放 天 敌，保 护 天 敌，创 造 有 利 于 天 敌 生 存 的 环 境，选 择 对 天 敌 杀 伤 力 低 的 农 药。6.6 化 学 防 治6.6.1 防 治 原 则对 症 下 药，适 期 用 药，交 替 使 用。运 用 适 当 的 浓 度 与 剂 量，合 理 混 配，严 格 控 制 用 量。6.6.2 黑 斑 病用 6 0%唑 醚 代 森 联 1 0 0 0 倍 液 或 2 5%嘧 菌 酯 1 5 0 0 倍 液 浸 泡 茎 基 部 6 c m 1 0 c m 处 1 0 m i n 1 2 m i n，然 后再 进 行 扦 插。6.6.3 根 腐 病用 7 7%氢 氧 化 铜 可 湿 性 粉 剂 5 0 0 倍 液 等 喷 雾 防 治。6.6.4 蚜 虫用 1 0%啶 虫 脒 3 0 0 0 倍 液 喷 雾 防 治。D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 846.6.5 地 老 虎 和 蛴 螬用 0.2%联 苯 菊 酯 颗 粒 剂 亩 施 3 5 k g 或 1%联 苯 噻 虫 胺 颗 粒 剂 亩 施 5-6 k g，可 结 合 后 期 施 肥 一 同 施 下。7 抽 样7.1 脱 毒 组 培 苗 抽 样7.1.1 脱 毒 核 心 材 料 必 须 每 株 都 进 行 检 测。7.1.2 扩 繁 组 培 苗 随 机 抽 取 1%2%。7.2 甘 薯 脱 毒 种 苗 抽 样采 收 前 1 周，在 目 测 全 田 基 础 上，采 用 五 点 取 样 法，抽 样 数 量 为：1 0 0 0 m2以 下 2 0 0 株；1 1 0 0 1 0 0 0 0h m25 0 0 株；病 毒 检 测 每 株 取 茎 蔓 上、中、下 部 叶 片 各 1 片，应 液 氮 或 干 冰 保 存，一 天 内 检 测。8 检 测8.1 生 物 学 方 法8.1.1 目 测 法（外 观 症 状 诊 断 法）可 根 据 甘 薯 叶 片 上 出 现 的 典 型 症 状 判 断 甘 薯 是 否 带 毒。甘 薯 病 毒病 的 主 要 症 状 详 见 附 录 A。8.1.2 指 示 植 物 检 测 法 用 于 辅 助 检 测 甘 薯 羽 状 斑 驳 病 毒 和 甘 薯 潜 隐 病 毒。方 法：以 待 检 样 品 茎 蔓 为接 穗，巴 西 牵 牛 为 砧 木。将 待 检 样 品 茎 蔓 中 下 部 茎 段 切 成 3 段 5 段，每 个 接 穗 带 一 个 单 芽 及 叶 片，去叶 后 将 底 端 削 成 楔 形，插 入 巴 西 牵 牛 砧 木 切 口 内，封 口 膜 扎 紧。巴 西 牵 牛 生 长 出 1 2 片 真 叶 时 嫁 接，嫁 接 后 白 天 保 持 气 温 2 6 3 2，相 对 湿 度 8 0%9 0%，适 当 遮 荫，嫁 接 成 功 后，给 予 充 足 光 照。嫁 接 后2 周 3 周 显 症，在 所 有 嫁 接 指 示 植 物 中 只 要 有 一 株 植 物 叶 片 表 现 羽 状 斑 驳 症 状 即 存 在 羽 状 斑 驳 病 毒，叶 脉 变 黄 则 存 在 甘 薯 潜 隐 病 毒，叶 片 褪 绿 斑 则 存 在 甘 薯 褪 绿 斑 病 毒。8.2 酶 联 免 疫 吸 附 法（E L I S A）当 组 培 苗 展 开 叶 达 6 片 以 上 时 进 行 检 测，检 测 方 法 见 附 录 B。8.3 R T-P C R 技 术运 用 R T-P C R 技 术 对 提 取 的 甘 薯 叶 片 总 R N A 进 行 检 测。9 质 量 要 求凡 酶 联 免 疫 检 测、R T-P C R 检 测 或 指 示 植 物 检 测 呈 阳 性 者 为 带 毒（苗），其 中 原 种 病 毒 病 株 允 许 率 2.0%，生 产 用 种 病 毒 病 株 允 许 率 1 0%。脱 毒 种 苗 分 级 以 繁 殖 田 播 种 的 种 薯 级 别、带 病 植 株 比 率、混 杂植 株 比 率 为 定 级 标 准。只 要 检 出 根 腐 病、根 结 线 虫 病、甘 薯 瘟、甘 薯 茎 腐 病、甘 薯 小 象 甲（蚁 象），即不 能 作 为 种 苗。具 体 见 附 录 A。1 0 生 产 用 脱 毒 种 苗 收 获D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 85次 级 脱 毒 种 苗 及 三、四 级 脱 毒 种 苗 均 可 作 为 生 产 用 脱 毒 种 苗，作 生 产 用 脱 毒 种 苗 时，应 剪 取 3 4节 为 1 株 苗。不 同 品 种 单 收 单 放，做 好 标 记 严 禁 混 杂。1 1 生 产 模 式 图生 产 技 术 模 式 见 附 录 C。D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 86A A附 录 A（资 料 性 附 录）甘 薯 主 要 病 虫 害 症 状甘 薯 主 要 病 虫 害 症 状 参 见 表 A.1。表 A.1 甘 薯 主 要 病 虫 害 症 状病害名称 植株 块根甘薯病毒病苗 期 叶 片 褪 绿 斑 点 或 轻 微 褪 绿 半 透 明 斑，边 缘上 卷，生 长 后 期，有 些 斑 点 四 周 呈 紫 褐 色 或 形 成 紫环 斑，多 数 品 种 沿 叶 脉 形 成 紫 色 羽 纹 状；发 展 到 一定 时 期，叶 片 皱 缩 黄 化，叶 缘 不 整 齐 或 扭 曲，有 与中脉平行的褪绿半透明斑，个别植株有丛生现象。薯 块 上 产 生 黑 褐 色 或 黄 褐 色 龟 裂 纹，排 列 成横 带 状 或 贮 藏 后 内 部 薯 肉 木 栓 化，剖 开 病 薯 可 见肉质部具黄褐色硬脆斑块。甘薯细菌性萎蔫病（甘薯瘟）从 育 苗 到 结 薯 均 能 发 病。晴 天 中 午，病 苗 顶 部叶 片 萎 垂，茎 基 呈 现 黑 褐 色 水 烂 状，维 管 束 从 上 而下 黄 褐 色 条 纹 状，严 重 时，茎 内 全 部 腐 烂，仅 残 留纤 维。成 株 发 病，叶 色 暗 淡，无 光 泽，蔓 出 现 水 渍状 斑 点，呈 黑 褐 色，剖 视 维 管 束，褐 色 条 纹 用 手 拉易脱皮，留下纤维。轻病薯块乳汁明显减少，有臭味，煮后不烂，外 表 症 状 常 部 明 显，仅 薯 蒂 附 近 呈 黑 褐 色 或 尾 根呈 不 同 程 度 病 变，剖 开 横 切 面 为 分 散 的 褐 色 小 斑点 或 黄 褐 色 至 深 褐 色 斑 块，纵 切 面 从 藤 头 或 自 尾根始，维管束呈黄褐色条纹状，可挤出乳状菌脓。重 症 薯 块，整 块 呈 黑 褐 色 腐 烂 或 一 端 腐 烂，有 脓液状或淡黄色菌液，臭味浓烈。甘薯黑斑病茎基部形成黑褐色梭形或椭圆形病斑，稍凹陷，病 斑 初 期 有 灰 色 霉 层，后 变 为 黑 色 粉 状 物，病 斑 逐渐扩大，重者基部全部变黑，枯死。薯 块 上 形 成 黑 色 近 圆 形 病 斑，病 部 稍 凹 陷，病 健 交 界 明 显，组 织 坚 实，如 用 刀 横 割 病 斑 部，可见薯皮下的薯肉呈青褐色或黑褐色，深0.5 c m 2 c m，有强烈的臭味。病部木栓化，坚硬，干腐，在适当条件下，病斑中央会长出黑色刺毛状物-子囊壳。甘薯疮痂病叶 片 卷 皱 呈 木 耳 形；芽 僵 缩；茎 蔓 和 叶 柄 生 出凸凹粗糙的病斑，病蔓先端硬化僵直不再完全伏地；顶 芽 受 害 病 斑 初 为 透 明 深 红 色，扩 大 后 逐 渐 变 黑 褐色 而 枯 死；新 梢 和 幼 叶 不 能 长 大，整 个 顶 梢 收 缩 僵硬而直立，表现粗糙成麻脸状。薯 块 表 面 产 生 暗 褐 色 至 灰 褐 色 小 点 或 于 斑，干燥时疮痂易脱落，残留疹状斑或疤痕。甘薯蔓割病幼 苗、叶 脉 间 叶 肉 变 黄，茎 内 维 管 束 变 褐 色。潮 湿 时，病 部 产 生 白 色 至 粉 红 色 的 霉 层。轻 者 分 枝增 生 和 节 间 缩 短，茎 基 膨 大，出 现 青 晕，表 皮 似 裂呈 丝 状。罹 病 植 株 发 生 全 株 性 枯 萎、死 亡，地 上 部叶片自下而上变黄脱落，茎开裂。维 管 束 变 褐，横 切 薯 块 蒂 部，可 见 褐 色 圆 环形 斑 点，严 重 时，上 部 茎 蔓 枯 死，而 薯 块 并 不 腐烂，且在土表抽出很多幼蔓。甘薯根腐病根系腐烂，多从不定根的尖端或中部开始变黑，逐 渐 向 上 蔓 延 至 根 茎 部 位 1 2 个 叶 节，形 成 黑 褐 色病斑。病斑表皮纵裂，重病株地下根茎大部分变黑，地 上 部 茎 蔓 缩 短，分 枝 少 或 无 分 枝，形 成 独 杆 苗，一 般 不 结 薯，轻 病 株 结 薯 畸 形，呈 大 肠 状 或葫 芦 状，表 皮 松 软，表 面 小 病 斑，用 手 一 拉 就 下来，未向薯肉深入。D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 87叶 片 发 黄、反 卷、叶 变 小，组 织 硬 化 且 脆，叶 片 自下 而 上 干 枯 脱 落，植 株 大 量 现 蕾 开 花，常 造 成 大 片死苗，重者全部死亡。甘薯根结线虫病根 系 形 成 绳 结 状，使 地 下 部 多 牛 蒡 状，毛 根 纵生，细 跟 上 有 米 粒 大 小 的 根 结，有 的 成 串，剥 开 根结，可见一至数个雌虫。龟裂型：块根畸形，褐色纵裂口棒根型：粗1 c m 2 c m，棒状块根线根型：只有线状牛蒡根，不膨大成薯块。甘薯茎线虫病苗 期：发 病 重 的 出 苗 稀、矮 小、发 黄，剖 视 茎基 部，内 有 褐 色 空 隙，剪 断 后 不 流 或 很 少 流 白 浆。后 期 侵 入 部 位 表 皮 裂 成 小 口，髓 部 呈 褐 色 干 腐 状，剪 断 后 无 白 浆。茎 蔓 症 状：主 蔓 基 部 髓 部 先 白 色 干腐，后 渐 变 褐 色，严 重 时 基 部 蔓 短、叶 黄，甚 至 主蔓枯死。根部症状：根部表皮坏裂。糠 心 型：薯 苗、种 薯 带 病，先 块 根 纵 剖 面 内部 呈 稀 絮 状 白 色 糠 道，后 期 由 于 伴 随 其 他 杂 菌 形成 褐 色 相 间 的 褐 色 糠 道。有 时 内 部 虽 毁 坏，但 外表接近健者。裂 皮 型：发 病 轻 肉 眼 不 易 看 出，开 始 外 皮 褪色，不 久 变 青，有 的 稍 凹 陷，有 的 有 小 裂 口，皮下 组 织 变 褐，最 后 皮 色 呈 暗 紫 色，并 多 龟 裂，内呈褐白相间的干腐。甘薯茎腐病甘 薯 茎 枝 在 发 病 初 期，病 株 生 长 较 为 缓 慢，在与 土 壤 接 触 的 茎 基 部 会 产 生 褐 至 黑 色、水 渍 状 的 病斑，最 后 软 化 解 离，导 致 枝 条 末 端 的 部 分 萎 凋。此外，根茎维管束组织有明显的黑色条纹、并有恶臭。在 高 温 高 湿 的 条 件 下，茎 部 腐 烂 迅 速 向 上 扩 展，呈黑 色，茎、叶 组 织 开 始 变 软、腐 烂，整 个 植 株 发 病倒伏，最后全株枯萎死亡。薯块表面有黑色凹陷病斑,或外部无症状，内部腐烂，受侵染组织呈水浸状。甘薯小象甲（蚁象）外 露 的 块 根 和 茎 叶 被 啃 食，常 使 植 株 变 黄，重者死亡，造成田间缺苗。幼 虫 危 害 薯 块，取 食 成 蛀 道，且 排 泄 物 充 斥于 蛀 道 中，能 诱 导 薯 块 产 生 萜 类 和 酚 类 物 质，使薯块变苦。D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 88B B附 录 B（资 料 性 附 录）斑 点 酶 联 免 疫 检 测 法（D O T-E L I S A）B.1 试 剂所 用 化 学 试 剂 为 分 析 纯 级 规 格，用 水 为 蒸 馏 水。B.1.1 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（T B S）（p H 7.5）T i r s B a s e 4.8 4 g氯 化 钠（N a C l）5 8.4 4 g叠 氮 钠（N a N 3）0.4 0 g溶 于 1 9 9 0 m l 蒸 馏 水 中，用 盐 酸（3 7%）调 p H 至 7.5，定 容 至 2 0 0 0 m l。B.1.2 洗 涤 缓 冲 液（T-T B S）1.0 m l 吐 温-2 0（T w e e n-2 0）溶 于 2 0 0 0 m l T B S 中。B.1.3 抽 提 缓 冲 液亚 硫 酸 钠（N a 2 S O 3）0.2 g 溶 于 T B S 中，定 容 至 1 0 0 m l。B.1.4 封 闭 缓 冲 液（现 用 现 配）脱 脂 奶 粉 0.5 0 g粹 通 X-1 0 0（T r i t o n X-1 0 0）0.5 m lT B S 2 5 m l先 将 脱 脂 奶 粉 溶 于 少 量 T B S 中，再 用 T B S 定 容 至 2 5 m l。加 入 T r i t o n X-1 0 0 混 合 均 匀。B.1.5 抗 体 稀 释 缓 冲 液脱 脂 奶 粉 1.0 0 gT B S 5 0 m l先 将 脱 脂 奶 粉 溶 于 少 量 T B S 中，再 用 T B S 定 容 至 5 0 m l。B.1.6 底 物 缓 冲 液（p H 9.5）T r i s B a s e 6.0 5 g氯 化 钠（N a C l）2.9 2 g氯 化 镁（M g C l 26 H 2 0）0.5 1 g叠 氮 钠（N a N 3）0.0 5 g溶 于 4 5 0 m l 蒸 馏 水 中，用 浓 盐 酸 调 p H 至 9.5，定 容 至 5 0 0 m l。B.1.7 硝 基 蓝 四 唑 盐（N B T）和 5-溴-4-氯-3-吲 哚 磷 酸 酯（B C I P）储 备 液N B T 储 备 液：N B T 0.0 4 gD B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 897 0%N,N-二 甲 基 甲 酰 胺 1.2 m l混 合 均 匀，4 避 光 保 存。B C I P 储 备 液：B C I P 0.0 2 g7 0%N,N-二 甲 基 甲 酰 胺 1.2 m l混 合 均 匀，4 避 光 保 存。B.1.8 底 物 溶 液（现 用 现 配）底 物 缓 冲 液 2 5 m lN B T 储 备 液 7 5 lB C I P 储 备 液 7 5 l先 将 N B T 储 备 液 溶 于 2 5 m l 底 物 缓 冲 液 中，再 逐 滴 加 入 B C I P 储 备 液，边 加 加 振 摇 混 匀。B.2 样 品 制 备将 待 检 叶 片 用 清 水 清 洗 干 净，从 每 一 样 品 叶 片 上 各 取 一 直 径 约 1 c m 圆 片，放 入 样 品 袋 中，加 入 3 m l抽 提 缓 冲 液 充 分 研 磨，4 静 置 3 0 m i n 4 0 m i n，取 澄 清 汁 液 点 样。样 品 为 块 根 时，催 芽 处 理 后 取 幼 芽、叶 制 样。B.3 操 作 步 骤B.3.1 点 样将 打 好 方 格 的 硝 化 纤 维 素 膜 用 T B S 缓 冲 液 处 理 后 放 在 洁 净 的 滤 纸 上，每 个 样 品 各 吸 取 1 7 l 上 清 液 滴在 膜 上 方 格 的 正 中，干 燥 1 5 m i n 3 0 m i n。同 时 设 阳 性、阴 性 和 空 白 对 照，可 根 据 需 要 设 置 重 复。B.3.2 封 闭将 干 燥 后 的 膜 浸 泡 在 封 闭 缓 冲 液 中，室 温 下 摇 床 振 荡（5 0 r/m i n）1 h。B.3.3 孵 育 第 一 抗 体将 膜 置 于 用 抗 体 缓 冲 液 稀 释 至 工 作 浓 度 的 抗 血 清 中，室 温 下 摇 床 振 荡（5 0 r/m i n）过 夜。B.3.4 洗 涤用 洗 涤 缓 冲 液 洗 膜 3 次，每 次 摇 床 振 荡（1 0 0 r/m i n）3 m i n。B.3.5 孵 育 第 二 抗 体将 膜 置 于 用 抗 体 缓 冲 液 稀 释 至 工 作 浓 度 的 酶 标 抗 体 中，室 温 下 摇 床 振 荡（5 0 r/m i n）1 h。B.3.6 洗 涤洗 涤 4 次，方 法 同 A 3.4。B.3.7 显 色将 膜 置 于 N B T/B C I P 底 物 溶 液 中，室 温 下 摇 床 振 荡（5 0 r/m i n）孵 育 3 0 m i n。D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 81 0B.3.8 终 止 反 应弃 去 底 物 溶 液 并 用 蒸 馏 水 洗 膜 3 次，每 次 摇 床 振 荡（1 0 0 r/m i n）3 m i n。B.3.9 阳 性 判 断晾 干 后 观 察 颜 色 反 应，出 现 蓝 紫 色 颜 色 反 应 的 样 品 为 阳 性。D B 3 3 0 1/T 1 0 8 9 2 0 1 81 1附 录 C（资 料 性 附 录）甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 模 式甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 模 式 参 见 图 C.1。图 C.1 甘 薯 脱 毒 种 苗 标 准 化 生 产 模 式 图_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _