ICS 67.050 X 04 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4043 2020 生鲜乳中 黄曲霉毒 素 B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定 液相色谱-柱后光化 学衍生法 Detection of aflatoxin B1、B2、G1、G2、M1、M2 contents in raw milk by liquid chromatography with post-column photochemical derivatization 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4043 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 东省 畜牧 局提 出并组 织实 施。本标准 由山 东省 畜牧 业标 准化技 术委 员会 归口。本 标准 起草 单位：山东 省 农科院 农业 质量 标准 与检 测技术 研究 所、青 岛农 业 大学、青 岛农 业大 学海都学院。本标准 主要 起草 人：王玉 涛、韩 荣伟、于 忠娜、蔡 达、徐 宁、张潇、高 磊、赵玉华、刘 俊华、秦 宏伟、邱 慧玲、王 军、盖学 武、焦 霞、杨永 新。DB37/T 4043 2020 1 生 鲜乳中 黄曲霉毒 素 B1、B2、G1、G2、M1、M2 的 测定 液相色 谱-柱后光 化学衍 生法 警示：整 个分 析操 作过 程 应在指 定区 域内 进行。该 区域应 避光(阳光)，具 备 相对独 立的 操作 台和 废弃物存 放装 置。在整 个实 验过程 中，操作 者应 按照 接触剧 毒物 的要 求采 取相 应的保 护措 施。1 范围 本 标准 规定 了测 定生 鲜乳中 黄曲 霉毒 素B1、B2、G1、G2、M1、M2 含 量的 液相 色谱-柱 后光 化学 衍生 测定方法。本标准 适用 于生 鲜乳 中黄 曲霉毒 素B1、B2、G1、G2、M1、M2 的 定量 测定。本标准 方法 的检出 限：黄 曲霉毒 素B1 为0.002 g/kg，黄曲 霉毒 素B2 为0.002 g/kg，黄 曲霉 毒素G2 为0.002 g/kg，黄曲 霉 毒素G1 为0.002 g/kg，黄 曲霉毒 素M1 为0.005 g/kg，黄 曲霉 毒素M2 为0.002 g/kg；本 标准 方法的 定 量限：黄曲 霉毒素B1 为0.006 g/kg，黄曲 霉毒 素B2 为0.005 g/kg，黄 曲霉毒素G2 为0.005 g/kg，黄 曲 霉 毒 素G1 为0.006 g/kg，黄 曲 霉毒 素M1 为0.015 g/kg，黄 曲 霉 毒素M2为0.006 g/kg。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 原理 试样中 的黄 曲霉 毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2 用 甲醇 溶 液提取，提取 液经 黄曲 霉 素毒素 免疫 亲和 柱净化、富 集，用高 效液 相色 谱分离 后经 柱后 光化 学衍 生，荧 光检 测器 检测，外 标法定 量。4 试剂和 材料 除非另 有说 明，在分 析中 仅使用 确认 为分 析纯 的试 剂，水 为GB/T 6682 中规 定 的一级 水。4.1 甲醇：色谱 纯。4.2 乙腈：色谱 纯。4.3 甲醇水 溶液：取50 mL 甲 醇，加 入50 mL 纯水，混 合均匀。4.4 流动相：乙 腈+水=20+80。分别 取200 mL 乙腈，800 mL 水，混 合均 匀，并脱 气 备用。4.5 黄曲霉 毒素（B1、B2、G1、G2、M1、M2）标准 储备 溶液：采 购市售 标准 溶液，分 别用 甲醇配 成 100 ng/mL的标准 储备 液。储备 液于-4 避 光保 存（有效 期三 个月）。4.6 免疫亲 和柱：柱 容量 100 ng(柱 容量、回 收率、柱 回收率 验证 方法 参见 商品 说明书)。注：对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。DB37/T 4043 2020 2 4.7 滤膜：0.45 m 有 机滤 膜。5 仪器设 备 5.1 液相色 谱仪：荧 光检 测器。5.2 光化学 衍生 装置。5.3 分析天 平，感 量0.01 g。5.4 固相萃 取装 置。5.5 旋涡混 合器。5.6 冷冻离 心机：转 速不 小 于10 000 r/min。5.7 氮吹仪。6 测定步 骤 6.1 提取 称取20 g 样 品，精 确到0.01 g，置 于50 mL 的 离心 管中，加入10 mL 甲醇，涡旋5 min，以10 000 r/min的转速 在-5 条件 下于 冷 冻离心 机离 心10 min，取 上清液 加水 定容 至50 mL，备用。6.2 净化 将低温 下保存 的免 疫亲和 柱恢复 至室温，待 免疫亲 和柱内 的液体 放弃 后，将 上述样 液移至50 mL 注射器筒 中，控 制流速 为1 mL/min 3 mL/min。待样 液 滴完后，往注 射器筒 内加 入10 mL 水，以稳定 流速淋 洗 免 疫 亲 和 柱 后，吹 干 亲 和 柱。加 入2 2 mL 乙腈(或甲醇)洗 脱 亲 和 柱，控 制 流 速 为1 mL/min 3 mL/min，吹 干亲和 柱，收 集全部 洗脱液 至刻 度试管 中。在50 下氮气 缓缓 地 将洗脱 液吹至 近干，用初始流动 相定 容至1.0 mL，涡旋30 s 溶 解残 留物，0.45 m 有机 滤膜 过滤，供 液 相色谱 测定。6.3 标准曲 线配 置 用流动 相（4.4）将 黄曲 霉 毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2 稀释成0.1 ng/mL 10.0 ng/mL 的 系列 标准 溶液。6.4 测定 6.4.1 液相 色 谱参 考条 件 液相色 谱参 考条 件列 出如下：a)色谱柱：C18 柱（柱 长 250 mm，柱内 径4.6 mm，填 料粒 径 5 m）；b)流动相：乙 腈+水（20+80，体积 比）；c)柱温：30；d)流速：0.8 mL/min；e)进样量：20 L；f)检测器：荧 光检 测器；g)检测波 长：EX（激发 波长）=355 nm，EM（发 射波 长）=430 nm。6.4.2 定量测 定 DB37/T 4043 2020 3 根据试 样溶 液中 黄曲 霉毒 素B1、B2、G1、G2、M1、M2 的 含量情 况，选定 浓度 相近 的混合 标准 工作 溶液，混合标 准工 作溶 液中 黄曲 霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2 的响 应值 应在 仪器 检 测的线 性范 围内。对混 合 标准工作 溶液 和试 样溶 液等 体积注 入液 相色 谱仪。按 照保留 时间 进行 定性，以 标准曲 线进 行定 量测 定。标准品色 谱图 参见 附录A中图A.1。6.5 空白试 验 除不称 取试 样外，均 按上 述步骤 同时 完成 空白 试验。7 试验数 据处 理 试样中 黄曲 霉毒 素以B1、B2、G1、G2、M1、M2 分别 计，单 位为微 克每 千克（g/kg），按 下列 公式（1）计算：.(1)式中：试 样中 黄曲 霉毒 素B1、B2、G1、G2、M1、M2 的含 量，单 位为 微克 每千 克（g/kg）；从 标准 工作 曲线 上得 到的被 测组 分溶 液浓 度，单位为 纳克 每毫 升（ng/mL）；V 样品 溶液 定容 体积，单位 为毫 升（mL）；m 样品 溶液 所代 表试 样的质 量，单位 为克（g）。计算结 果需 扣除 空白 值，测定结 果用 平行 测定 的算 术平均 值表 示，结果 保留 三位有 效数 字。8 重复性 在重复 性条 件下 获得 的两 次独立 测定 结果 的绝 对差 值不得 超过 算术 平均 值的20%。DB37/T 4043 2020 4 A A 附 录 A（资料 性附 录）黄曲霉 毒 素 B1、B2、G1、G2、M1、M2 液相 色谱 图 说明：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2 标准溶液浓度分别为3.92 ng/mL、1.02 ng/mL、3.9 ng/mL、1.0 ng/mL、1.0 ng/mL、1.0 ng/mL。图A.1 高效液 相色 谱分 离黄 曲霉 毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2 的标准 图谱 _