ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 30912019 鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for the detection of Tuberculosis pathogenic organism in deer 2019-12-25发布 2020-02-01实施吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 30912019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学，中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：曾范利、李健明、时坤、宗颖、冷雪、赵丹、杜锐、徐超。DB22/T 30912019 1 鹿结核病病原菌实时荧光PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了鹿结核病病原菌实时荧光PCR检测方法的试剂仪器、操作程序、结果判定。本标准适用于梅花鹿、马鹿组织器官、血液中的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 实时荧光 PCR Real-time PCR 一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。3.2 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号量到达设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。EDTA 乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution）5 原理 以 DNA 为模板进行PCR扩增，通过该反应，利用荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，是否获得目的基因，并最终计算待测样品模板的初始浓度。6 试剂和材料 DB22/T 30912019 2 6.1 试剂 除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。6.1.1 实时荧光 PCR 扩增所用的引物序列见表 1。表1 引物序列 类别 核酸序列（5-3）上游引物5-AGACCCCGGGACCTTCACTACAAC-3 下游引物5-AACGACTCCGCCCCAACTG-3 结核分枝杆菌 探针5-FAM-ACGGTTTGTGTAGGATAGGTGGGA-TAMRA-3 上游引物5-CGGGCGTTTTGTCGCATCC-3 下游引物5-GGGCGTGGGCAGACTTCGT-3 牛分枝杆菌 探针5-FAM-CTTGCGGAGGAGGTTGGGGACA TAMRA-3 6.1.2 动物血液与组织 DNA 提取试剂盒。6.1.3 Taq 酶。6.1.4 磷酸盐缓冲液（PBS）(0.01 mol/L,pH 7.4)。6.1.5 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)。6.2 材料 6.2.1 离心管（50 mL、15 mL、1.5 mL）。6.2.2 吸头（200 L1000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。6.2.3 荧光定量 PCR 管。7 仪器设备 7.1 电子天平，感量 0.01 g。7.2 荧光定量 PCR 仪。7.3 台式低温高速离心机（4，13000 r/min）。7.4 移液器（200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L）。7.5 恒温水浴锅。8 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应按 GB 19489 和 GB/T 27401 的有关规定执行。9 操作步骤 9.1 样品的采集和保存 9.1.1 组织样品的采集和保存 采集下颌、咽后、肺门、肠系膜淋巴结，肺，肝，脾等组织样品不少于 5 g。做好标识，置于密闭容器内，冷冻或4 冷藏保存和运输。DB22/T 30912019 3 9.1.2 血液样品的采集和保存 使用EDTA作为抗凝剂，无菌采集静脉血不少于 5 mL，样品采集后于 2 8 冷藏保存，然后立即运送实验室（夏季不超过 24 h，冬季不超过 2 d）。短时间不能送达的样品应于-20 冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，不应反复冻融。9.2 DNA 提取 按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的 DNA。9.3 对照样品 9.3.1 阳性对照 取结核分枝杆菌标准菌株灭活菌，牛结核分枝杆菌灭活菌作为阳性对照。9.3.2 阴性对照 取标准阴性样品作为阴性对照。9.3.3 空白对照 去离子水。9.4 扩增反应体系 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 2。表2 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 premix Ex TaqTM I(2）13.5l 上游引物(0.4 mol/L)0.5 L 下游引物(0.4 mol/L)0.5 L 探针（0.3mol/L）1 L 待检 DNA 模板 2 L ddH2O 7.5 L Total 25 L 注：上游、下游引物为结核分枝杆菌的引物。DB22/T 30912019 4 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 扩增反应体系见表 3。表3 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应体系 试剂 剂量 premix Ex TaqTM I(2）12.5l 上游引物(0.3 mol/L)0.5 L 下游引物(0.3 mol/L)0.5 L 探针（0.2mol/L）1 L 待检DNA 模板 2 L ddH2O 8.5 L Total 25 L 注：上游、下游引物为牛分枝杆菌的引物。9.5 反应程序 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序见表 4。表4 结核分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序 反应步骤 时间/s 温度/第一步 30 95 5 95 第二步（40个循环）30 55 注：荧光收集设置在每次循环55 30 s时进行。牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序见表 5。表5 牛分枝杆菌实时荧光 PCR 反应程序 反应步骤 时间/s 温度/第一步 30 95 5 95 第二步（40个循环）30 60 注：荧光收集设置在每次循环60 30 s时进行。DB22/T 30912019 5 10 结果判定 10.1 质控标准 10.1.1 阳性对照 阳性对照的 Ct 值应35.0，并出现特定的扩增曲线。10.1.2 阴性对照 空白对照、阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。10.1.3 有效原则 如阳性对照、阴性对照任意一项不满足以上条件，此次试验视为无效。10.2 结果描述与判定 10.2.1 阳性结果 待检样品能够扩增出结核分枝杆菌或牛分枝杆菌 S 型曲线，并且 Ct 值在预期的范围之内（35.0）判为核酸阳性。10.2.2 阴性结果 检测结果呈现无 Ct 值并且无扩增曲线的反应判为核酸阴性。10.2.3 可疑结果 对于 35Ct 值40 的样品，应进行重复试验。如果重复试验的 Ct 值40，且曲线有明显的对数增长期，判为核酸阳性反应。DB22/T 30912019 6 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配制 A.1 磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.4）的配制 称取 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和 0.24 g KH2PO4，溶于 800 mL 蒸馏水中，用盐酸（HCl）调 pH至 7.4，定容至 1L，采用(1212)/0.1 MPa高压下蒸气灭菌（至少 20 min），保存于室温或 4 冰箱中。或按照商品化说明书配制。A.2 0.5molL EDTA(pH 8.0)的配制 称取186.1 g EDTA，加入800 mL 蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠(NaOH)调pH至8.0，定容至1 L，分装，采用(1212)/0.1MPa，15 min高压灭菌后贮存于室温。_