ICS 67.0 50 X 04 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 1669 2018 陆川猪肉及其制品的 DNA 分子鉴定方法 DNA molecular identification method of Luchuan pig meat and its products 2018-03-25 发布 2018-04-25 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发布 DB 45/T 1 66 9 20 18 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语和定 义.1 4 原理.2 5 仪器与试 剂.2 6 鉴定步骤.2 7 结果判定 与表述.3 8 实验室防 污染措施.4 附录 A（资料 性附录）陆川猪肉特异性条带的核苷酸序列信息.5 附录 B（规范 性附录）P CR 所用引物 序列.6 附录 C（资料 性附录）样品 DN A 提 取方法.7 附录 D（资料 性附录）1.8%琼脂糖凝 胶的制备.8 DB 45/T 1 66 9 20 18 II DB 45/T 1 66 9 20 18 III 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西大学提出。本标准起草单位：广西大学、广西分析测试研究中心、广西经贸职业技术学院、广西陆川县质量技 术监督局。本标准主要起草人：黄丽、滕建文、杨磊、黄岛平、庞理松、夏宁、林葵、韦保耀、庞丽、李中宇。DB 45/T 1 66 9 20 18 1 陆川猪肉及其制品的 DNA 分子鉴定方法 1 范围 本标准规定 了陆川猪肉 及其制品的DNA分子鉴定的术语和定 义、原理、仪器与试剂、鉴定步骤、结 果判定与表述和实验室防污染措施的要求。本标准适用于广西壮族自治区内陆川猪肉及其制品的DN A分 子鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6 68 2 分析实验用水规格和试验方法 GB/T 2 74 03 实验室质量 控制规范 食品分子生物学检测 NY/T 2 99 3 陆川猪 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。3.1 陆川猪肉 L uc hu an p ig me at 来源于NY/T 29 93中纯种陆川猪生猪，以及以纯 种陆川猪为 母系进行杂 交后的杂元 陆川猪生猪 的酮 体。注：杂元陆川猪包括二元杂陆川猪和三元杂陆川猪。3.2 陆川猪肉制品 me at p r od uc ts o f L uc hu an p ig 以陆川猪肉为原料，经过相应工艺加工制成的扣肉、腊肉、腊肠、猪蹄等肉制品的总称。3.3 聚合酶链反应 polymerase cha in reaction；PCR 由“热变性 复性延 伸”三步反 应组成一个 循环，经过 多次循环反 应，使目标DNA得以大量扩增 的一种在体外快速扩增特定基因或DN A 片段的方 法。3.4 特异性引物 s pe ci fi c p ri me r 在PCR反应中与模板 DNA 两端分别特 异性结合，针对特定模板 DNA片段设 计的两段与 模板两端分 别 互补的一对寡核苷酸序列。4 原理 DB 45/T 1 66 9 20 18 2 利 用DN A提取 试剂 盒，提取样品中的DN A，以提取的DN A为 模板 进行 PC R扩增，琼脂糖凝胶 电泳 检测P CR 扩增 产 物，从而 对生 鲜 猪肉及制品的原料 属 性是 否归属 陆川猪肉进行判 断。特异性条带的核苷酸序列信 息 参见 附录A。5 仪器与试剂 5.1 主要仪器及耗材 5.1.1 PC R 仪。5.1.2 电泳 仪。5.1.3 凝胶成 像 仪。5.1.4 高速冷冻离 心 机。5.1.5 小型离 心 机（7 00 0 rp m）。5.1.6 冷藏冷冻冰箱。5.1.7 漩涡振荡 器。5.1.8 微 量 移液 器（10 L、1 00 L、1 00 0 L）。5.1.9 0.2 mL 普 通 PC R 管。5.1.10 一次性 P E手 套。5.1.11 1.5 mL 离 心 管。5.2 主要试剂 5.2.1 除另 有规定 外，所有试剂 均 为分析纯 或者 生 化 试剂。5.2.2 实验用水：应 符合 G B/T 6 68 2 中 一 级 水的规格。5.2.3 DN A 提取试剂 盒。5.2.4 1 TA E缓 冲 液。5.2.5 2 E s P CR Ma st er Mi x（含溴酚蓝 染料）。5.2.6 Ma rk er 为 100 bp P lu s D NA la dd er。5.2.7 琼脂糖；电泳 纯。5.2.8 嗅化乙锭（E B）。5.3 特异性引物 根据 陆川猪 线粒 体 T YR P1 基因 的核苷酸序列 设计 的引物，WM 1 2扩增陆川猪的 基因片段 大 小 为1 50 0 bp，WM 1 4扩增 非 纯种陆 川猪的 基因 片段 大 小 为 800 bp 90 0 bp。P C R所用引物序列 见 附录B，使用前 先 对其进行 预处 理，使用 小型离 心 机 对引物进行2 s左右离 心，后加 入说明书上 标注的 各 引物 稀释 所 需 体 积 的 dd H 2 O，使引物 浓度达到 10 M，完 成后 将 引物 放入-20 冰 箱 中保 存 备用。6 鉴定步骤 6.1 样品 DN A 提 取 依 照DN A提取 试剂 盒 中 D NA提 取 操作 进行提取，方法 参 照附录C。6.2 PC R 反应 DB 45/T 1 66 9 20 18 3 在冰浴条件下，按25 L 的PC R反应体 系用量在PC R 反应 管中分别加入各PC R 试剂，每个样本做三个 平 行，同时P CR扩 增 阴性对照和空白对照。配置体系时依照表1，最后加入模板DN A。表1 PC R 反应体系 试剂名称 剂 量 引物（上游）0.5 L 引物（下游）0.5 L 2 Es Taq Master Mix 12.5 L 模板 DNA 1.0 L 补 ddH 2 O 至 25.0 L 6.3 PC R 反应程序 95/5 m in预 变性；95/3 0 s变性，40/3 0 s退 火，7 2/2 mi n 延伸，3 54 0个循环；72/5 min 总延伸；4/5 mi n结束扩 增。PC R 产物 直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置于4 保存备 用。6.4 实验对照 6.4.1 阴性对照：将不含陆川猪血缘的猪肉或肉制品按 6.1 提取 D NA，按 6.2 配置 PC R 反 应体系，按 6.3 程序进 行 PC R 扩增。6.4.2 空白对照：以灭菌水代替 DN A 模板，按 6.2 配置 PC R 反应 体系，按 6.3 程序进行 P CR 扩增。6.5 琼脂糖电泳检测 PC R扩增完成后，尽快进行琼脂糖电泳检测，使用微量移液器取3 L扩增 产物，加入到浓度为1.8%的琼脂糖凝胶（1.8%琼 脂糖凝胶制备参见附录D）的上样孔中，同时加入3.5 L的Mar ke r，用 1 TA E作为缓冲液，按4 V/cm 设 定 电压，电泳2 h。6.6 紫外成像拍照 电泳结束后，小心地将凝胶从电泳槽中取出，放入盛有适当浓度溴化乙锭的避光容器里染色15 mi n左右，染 色完成后将凝胶转移到凝胶成像仪中观察拍照。拍照获得相应的电泳图进行结果判定。若不能 及时进行紫外拍照观察，应 将凝胶放入1TA E 缓冲液中暂时保存，但不宜超过4 h，超过应按步骤6.4和 6.5重做。7 结果判定与表述 7.1 质量控制 以下条件有一条不满足时，结果视为无效：空白对照：目标基因琼脂糖电泳检测无条带；阴性对照：WM 12 目 标基因琼脂糖电泳检测无 1 50 0 bp 对应条带。7.2 结果判定 DB 45/T 1 66 9 20 18 4 将电泳 后的琼脂糖凝胶 置 于凝胶成 像 仪内 观察，观察 测试样品琼脂糖 电泳 检测 图，按照以下方法进 行判定：如 测试样品 WM 12目 标 基因 琼脂糖 电泳 检测有 1 50 0 bp 对应条带，则 被 检样品为陆川猪肉及其 制品；如 测试样品 WM 12目标 基因 琼脂糖 电泳 检测 无 1 50 0 bp 对应条带，则 被 检样品为 非 陆川猪肉及 其制品；如 测试样品 WM 12目标 基因 琼脂糖 电泳 检测有 1 50 0 bp 对 应条带，WM 14 目 标 基因 琼脂 糖 电泳 检 测 没 有8 0 0 bp 90 0 bp 对 应条带，则 被 检样品为纯种陆川猪肉及其制品；如 测试样品 WM 12目标 基因 琼脂糖 电泳 检测有 15 00 bp 对 应条带，WM 14 目 标 基因 琼脂 糖 电泳 检 测有 80 0 bp 90 0 bp 对 应条带，则 被 检样品为杂元陆川猪肉及其制品。8 实验室防污染措施 按照GB/T 27 40 3的规定 执 行。DB 45/T 1 66 9 20 18 5 A A 附 录 A（资料性附录）陆川猪肉特异性条带的核苷酸序列信息 陆川猪肉特异性条带的核苷酸序列信息为：A CA AA GG GC TAC AA AC CA AA GCC TC AT CC TG CAC CC TT GC CT CAA GC AG GA TG AAA GC TC AG AA ACT CC TC TC TC TGG GG TA CA CT TT CT TG CC TCT GC TG TT TA TTC AG CA GG CC TGG GC TC AG TT CCC CA GA GA GT GTA CC AC CA TT GAG GC TT TG AG AAG TG GG GT AT GTTG CC CA GA TC TGT CC CC AC TG TCT GG GC CC GG GAC TG AC CG CT GTG GC TT CT CC TCA GG GA GG GG CAG GT GT GA GG CCG TG AC AG CA GACTC CC GA CC CC A CA GC CA DB 45/T 1 66 9 20 18 6 B B 附 录 B（规范性附录）PC R 所用引物 序列 表B.1给出了 PC R引物序列。表B.1 PC R 所用引物 序列 引物名称 引物序列 WM12 上游 5-CACCACCACGC-3 下游 5-CACCACCACGC-3 WM14 上游 5-CTCCTCCTCGC-3 下游 5-CTCCTCCTCGC-3 DB 45/T 1 66 9 20 18 7 C C 附 录 C（资料性附录）样品 DN A 提 取方法 C.1 方法说明 依照DN A提取 试剂 盒中 D NA提 取 说明进行操作。C.2 操作方法 C.2.1 将待检猪肉或肉制品，去除肥肉后，用灭菌刀切分。提取时切取0.5 g 肉样，剪碎后用干净镊 子 或药匙转移至干净的离心管中。C.2.2 向离心管中加入40 0 L B uf fe r L1 和20 L Fo re ge ne P ro te as e，涡旋混匀，放置于65 金 属浴 或水浴中25 m in 30 mi n，其 间每间隔10 m in涡旋混 匀 一次。C.2.3 加 入400 L B uffer L2，颠倒混 匀至 分层消 失，置于65 金 属浴或 水浴 中10 min，然 后12 000 rp m室温离心5 m in 10 mi n，收集上清 液。C.2.4 将上清液用 移液器 转移到离心 柱 中，再将离心 柱放入收集管中，12 00 0 rp m室 温离心1 mi n，弃 掉收集管中的废液。C.2.5 向离心柱中加入50 0 L B uf fe r P W，12 00 0 rp m室 温离心1 mi n，弃掉收集管中的废液。C.2.6 再向离心 柱 中加入 700 L Buffer W B，12 000 rpm 离心1 min，弃掉收集 管 中的废液；将离 心 柱 放回收集管中，12 00 0 r pm空管离心2 mi n，弃掉离 心柱中残余的Buf fe r W B。C.2.7 将离心柱移 至新 的1.5 mL离 心 管中，向膜中央悬 空滴加 100 L已 于 65 预 热的 B uffer EB，室 温放置 5 mi n，1 2 00 0 r pm离 心 1 mi n，收集洗脱液。再次向膜中央悬空滴加 10 0 L已 预热的Buf fer EB，12 00 0 r pm离 心 1 mi n，收 集洗脱液；将两次收集的洗脱液合并，即得样品DN A。D NA 提取后 置于-20 保 存。DB 45/T 1 66 9 20 18 8 D D 附 录 D（资料性附录）1.8%琼脂糖 凝胶的制备 D.1 将 凝胶 托架两端 用胶带 封闭并 水平 放置 在工 作台上，放上梳 子，使 梳齿 下 沿距托架板 0.5 mm 1.0 mm。D.2 配 制凝胶：称取 1.8 g 琼 脂糖于三 角瓶 中，加 入 10 0 mL 1 TA E 电泳缓冲液，加热 溶 解 琼脂糖。D.3 待 琼脂糖 溶液冷至 50 时，将 胶 液沿托架 胶 板 边 缓 慢连续 注 入，让 胶 液 自由 流 向各 方，凝胶 厚 度 控制在 3 mm 5 mm 之 间。待 凝胶 完 全 凝 固 后，撤 去两端 胶带。将托架放入电泳槽 中，加 入 1 TA E电泳 缓 冲液，使 之浸 过胶 面，拔 出 梳 子，待 用。中华人民共和国广西地方标准 陆川猪肉及其制品的 DNA 分子鉴定方法 DB45/T 1669 2018 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究