ICS 65.150 B 51 DB32 江苏地方标准 DB32/T 3771 2020 渔业养殖 用水中喹 诺酮类抗 生素测定 液相色谱-串联质谱 法 Determination of quinolones in aquaculture water by LC-MS/MS 2020-04-08 发布 2020-05-15 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3771 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由江 苏省 农业 农村 厅提出。本标准 由江 苏省 渔业 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：江 苏省 淡水水 产研 究所、江 苏省 水产质 量检 测中 心。本标准 主要 起草 人：孟勇、沈美 芳、朱晓 华、杨洪 生、王 静、张美 琴、谭秀 慧、刘 崇万、王 凯、朱凛。DB32/T 3771 2020 1 渔 业养殖 用水中喹 诺酮类 抗生素 测定 液 相色谱-串 联质谱 法 1 范围 本 标 准 规 定 了 渔 业 养 殖 用 水 中16 种 喹 诺 酮 类 抗 生 素 残 留 量 的 前 处 理 和 液 相 色 谱-串 联 质 谱 测 定 方法。本标准 适用 于渔 业养 殖用 水中恩 诺沙 星、诺氟 沙星、培氟 沙星、环 丙沙 星、氧氟沙 星、沙拉 沙星、依诺沙 星、洛 美沙 星、萘 啶酸、恶 喹酸、氟甲 喹、丹诺沙 星、双 氟沙 星、奥 比沙星、司帕 沙星、氟罗 沙星16种 抗生 素残 留量 的测 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其有 效版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法。3 原理 水样用混合纤维素滤膜过 滤后，喹诺酮类抗生素经 固相萃取柱富集、洗脱和 净化 后，供液相色谱-串联质 谱仪 测定，内 标法 定量。4 试 剂和 材料 4.1 甲 醇（CH3OH）。4.2 乙腈（CH3CN）。4.3 甲酸（HCOOH）。4.4 乙酸 铵（CH3COONH4）。4.5 氨水（NH3H2O）：优级 纯。4.6 5 mmol/L 乙酸铵缓 冲液：称 取 0.1925 g 乙酸 铵（4.4），溶 于 500 mL 水中。用 甲 酸（4.3）调 节pH 为 3 0.05。4.7 5%氨水 甲醇 溶液：量 取5 mL 氨水（4.5），用甲 醇 稀释 并定 容至100 mL。4.8 0.1%甲 酸水 溶液：量 取 1 mL 甲酸（4.3），用 水稀 释至 1000 mL。4.9 0.1%甲 酸水-乙腈：（9+1，体 积比），量取 90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和 10mL 乙腈（4.2）混合。4.10 标 准 物 质：恩 诺 沙星（Enrofloxacin）、诺 氟沙 星（Norfloxacin）、培氟 沙 星（Pefloxacin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙 星（Ofloxacin）、沙拉沙 星（Sarafloxacin）、依诺 沙星（Enoxacin）、洛美沙 星（Lomefloxacin）、萘 啶酸（Nalidixic acid）、恶 喹酸（Oxolinic acid）、氟 甲喹（Flumequine）、丹诺沙 星（Danafloxacin）、双氟沙 星（Difloxacin）、奥 比沙星（Orbifloxacin）、司 帕沙星（Sparfloxacin）、氟罗沙 星（Fleroxacin），纯度 97.0%。DB32/T XXXX 2020 2 4.11 内标 物质：氘 代诺 氟沙星，氘 代环 丙沙 星、氘代恩 诺沙 星，纯度 97.0%。4.12 喹诺 酮类 标准 储备 溶液：分 别称 取适 量喹 诺酮 类标准 品（4.10），用 甲醇(4.1)溶解 并定 容至 10 mL，使各种 喹诺 酮的 浓度 均 为 1.0 mg/mL。-18以下避 光保存，有 效 期 6 个 月。4.13 内标 标准 储备 溶液：分别 称取 适量 内标 标准 品（4.11），用 甲醇(4.1)溶 解并定 容至 10 mL，使各种内标 浓度 均 为 1.0 mg/mL。-18 以下 避光 保存，有 效期 6 个月。4.14 混合 标准 中间 溶液：分别量 取适 量标 准储 备溶 液(4.12)于 100 mL 棕色容 量瓶中，用甲 醇稀 释配 制成浓度 为 1 g/mL 的混合标准中间 溶 液。-18 以下 避光保 存，有效 期 3 个月。4.15 混合标 准工作 溶液：根据需 要用0.1%甲 酸水-乙 腈（4.9）由混合 标准中间 液（4.14）稀释成 合适的混合 标准 工作 溶液，现 配现用。4.16 混合内标 标准工作溶液：分别量取 适量 标准储备溶液(4.13)于100 mL 棕 色容量瓶中，用甲醇 稀释配制成 浓度 为1 g/mL 的混合 内标 标准 工作 溶液。-18 以下 避光 保存，有 效期3 个月。注：除 另有 说明 外，以下 所用的 试剂 均为 色谱 纯，试验用 水为GB/T 6682 规 定的一 级水。5 仪 器和 设备 5.1 液相 色谱-串联四 极杆 质谱仪，配 电喷 雾离 子源(ESI)。5.2 天平：感 量 0.01 g。5.3 分析 天平：感 量 0.00001 g。5.4 涡旋 混合 器。5.5 氮吹 仪。5.6 pH 计：测量 精度 0.05。5.7 刻度 玻璃 离心 管：10 mL。5.8 混合 纤维 素滤 膜：0.45 m。5.9 水系 滤膜：0.22 m。5.10 固相 萃取 柱：HLB 固相萃 取柱：500 mg，6 mL，或性能相 当者。5.11 固相 萃取 装置。6 样 品制 备与 保存 采集的 渔业 养殖 水 样 经0.45 m 混合纤 维素 滤膜 过滤。如水 样较 浑浊，可 更换 滤膜或 过滤2次。过 滤后的水 样于4 密封 保存，24 h内 进行 检测。取 过滤 后的 供试 样品，作为 供试 试料。取 过滤 后的 空白 样品，作为 空白 试料。取 过滤 后的 空白 样品，添加 适宜 浓度 的标准 工作 液，作为 空白 添加 试料。7 测 定步 骤 7.1 提取 和净 化 依次用6 mL 甲醇，6 mL 超纯水，6 mL 5 mmol/L 乙酸 铵缓冲 液（4.6）活化 小柱（5.10）。量取200 mL过滤后的试样，加入适量甲 酸调节水样pH 为3.0 0.05，准 确 加入1 g/mL 混合内标标准工作液50 L（4.16）。然后 以约35 mL/min 流速通过 固相 萃取 柱（5.10）。过 柱后 用6 mL 超纯水 淋洗，再将 小柱 于氮气保 护下 干燥20 min，最后用6 mL5%氨水甲 醇溶 液（4.7）分两 次进 行洗 脱。洗脱 液 于40 水浴 用氮DB32/T 3771 2020 3 气吹至 近干，用0.1%甲酸 水-乙腈（4.9）定 容至1 mL，涡旋混匀1 min，过0.22 m 水系滤膜，供 液相 色谱-串联质谱 仪测 定。7.2 标准 曲线 的制 备 精 确量 取适 量混 合标 准 中 间溶 液(4.14)和适 量 1 g/mL 混合内标 标 准工 作液（4.16），用 0.1%甲酸水-乙腈（4.9）配制 成同 位 素内标 浓度 为 50 ng/mL 以及 16 种喹 诺酮 浓度 为 1、5、10、20、50、100 和200 ng/mL 系列标准溶 液。以被测 组分 和相 应内 标 的 峰面积 比值 为纵 坐标，浓 度为横 坐标，绘制 标准 曲线，计 算回 归方 程和 相关 系数。7.3 测定 7.3.1 色谱 参考 条件 液相色 谱参 考条 件如 下：a)色谱柱：EC-C18柱，(2.1 mm x100 mm，2.7 m)，或性能 相当 者。b)流速：0.40 mL/min。c)柱温：30。d)进样量：10 L。e)A 为 0.1%甲酸 水溶 液(4.8)，B 为乙腈(4.2)；梯度 洗 脱程序 见 表 1。表 1 流动 相梯 度洗 脱程 序 时间/min A 相/%B 相/%0.00 95 5 2.00 85 15 10.00 45 55 12.00 10 90 13.00 95 5 15.00 95 5 7.3.2 质谱参 考条 件 质谱参 考 条 件如 下：a)离子化 模式：电 喷雾 离子 源(ESI)，正离 子模 式；b)喷雾电 压：5500 v；c)气帘气 流量：2 L/min；d)雾化气 流量：8 L/min；e)辅助加 热气 流量：8 L/min；f)离子源 温度：500；g)扫描模 式：多反 应监测(MRM)，扫描 参数 见附 录 A；7.3.3 定性测 定 在同样 测试 条件 下，试样 溶液中 各抗 生素 的保 留时 间与标 准物 质保 留时 间相 对偏差 在 2.5%以内，且 检测 到的 定性 离子 的相对 丰度，应 与浓 度相 当的标 准溶 液中 定性 离子 的相对 丰度 一致。基 峰与 次强碎片离 子丰 度比 应符 合 表 2 要求。各 抗生 素的 保留 时间参 考附 录 B。DB32/T XXXX 2020 4 表 2 基峰 与次 强碎 片离 子丰度 比要 求 次强碎片离子相对丰度%50 20 50 1020 1 0 允许相对偏差%20 25 30 50 7.3.4 定量 测定 将标准 工作 液和 试样 溶液 等体积 进样 测定，按 内 标 法进行 定量 分析，在样 品 中加入 回收 率指 示物，以 此来 保证 整个 样品 前处理 过程 的回 收率。诺 氟沙星、依 诺沙 星以 氘代 诺氟沙 星为 内标，环 丙沙 星、洛美沙 星以 氘代 环丙 沙星 为内标，恩诺 沙星、氧氟 沙星、培 氟沙 星、丹 诺沙 星、沙拉 沙星、司帕 沙星、双氟沙 星、恶喹 酸、氟甲 喹、萘 啶酸、氟 罗沙 星、奥比沙 星以 氘代 恩诺 沙星 为内标。7.3.5 空白 试验 除不加 试样 外，均按 上述 测定条 件和 步骤 进行。8 结 果计 算 试样中 喹诺 酮类 抗生 素含 量 按公 式(1)计算，计算 结 果需扣 除空 白值，结 果保 留三位 有效 数字。（1）式中：Xi 试样 中喹 诺酮 类抗 生 素含量，单 位为 纳克 每升(ng/L)；ci 试 样溶 液 中 喹诺 酮 类抗生 素的 浓度，单 位为 纳克每 毫升(ng/mL)；V1 试 样溶 液最终 体积，单位为 毫升(mL)；m 试 样体 积，单位 为升(L)。9 方 法灵 敏度、准 确度 和 精密度 9.1 灵敏 度 本方法 的 定 量限 为10 ng/L。9.2 准确 度 本方法 回收 率范 围为70%120%。9.3 精密 度 本方法 的批 内变 异系 数 15%，批 间变 异系 数 15%。mV cXiiDB32/T 3771 2020 5 附 录 A（资料 性附 录）扫描参 数 表A.1 16 种 喹诺 酮类 抗生 素及内 标物 的母 离子、子 离子和 碰撞 能量 序号 化合物 母离子/(m/z)子离子/(m/z)碰撞能 量/V 1 恩诺沙 星 360 245 38 316*26 2 诺氟沙 星 320 233 35 276*26 3 培氟沙 星 334 290 27 316*30 4 环丙沙 星 332 245 32 288*26 5 氧氟沙 星 362 261 26 318*38 6 沙拉沙 星 386 299 36 342*26 7 依诺沙 星 321 232 44 303*30 8 洛美沙 星 352 265 33 308*28 9 萘啶酸 233.3 215.2 28 187.4*44 10 恶喹酸 262 216 39 244*26 11 氟甲喹 262 202 25 244*40 12 丹诺沙 星 358 283 30 340*24 13 双氟沙 星 400 299 38 356*30 14 奥比沙 星 396 295 35 352*26 15 司帕沙 星 393 292 35 349*27 16 氟罗沙 星 370 269 37 326*27 17 氘代诺 氟沙 星 325 307 30 18 氘代环 丙沙 星 340 322 28 19 氘代恩 诺沙 星 365 321 29 注：*为定量离 子 DB32/T XXXX 2020 6 附 录 B（资料 性附 录）标准溶 液 液 相色 谱/串联 质 谱 色谱 图和 参考 保留 时间 XIC of+MRM(35 pairs):370.000/326.000 Da ID:FLE1 from Sample 2(STD 20ng/mL)of 20180523.wiff(Turbo Spray)Max.6.7e5 cps.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Time,min0.001.00e52.00e53.00e54.00e55.00e56.00e57.00e58.00e59.00e51.00e61.10e61.20e61.29e6I n t e n s it y,c p s3.76 图B.1 16 种喹 诺酮 标准 工作溶 液液 相色 谱/串联 质 谱XIC 色谱 图 图 B.2 16 种喹 诺酮 标准 工作溶 液液 相色 谱/串联 质 谱TIC 色谱 图 DB32/T 3771 2020 7 表B.1 16 种喹 诺酮 标准 工作溶 液 参 考保 留时 间 化合物 名称 保留时 间/min 化合物 名称 保留时 间/min 依诺沙 星 3.51 恩诺沙 星 4.14 诺氟沙 星 3.71 奥比沙 星 4.25 氧氟沙 星 3.72 沙拉沙 星 4.75 氟罗沙 星 3.76 司帕沙 星 4.77 培氟沙 星 3.78 双氟沙 星 4.84 环丙沙 星 3.82 恶喹酸 5.85 丹诺沙 星 3.93 萘啶酸 7.40 洛美沙 星 3.96 氟甲喹 7.99 _