ICS 67.050 X 04 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4010 2020 含阿胶的 食品中阿 胶含量的 测定方法 Method for determination of Ejiao content in Ejiao-containing food 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4010 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任。本标准 由青 岛海 关提 出、归口并 组织 实施。本标准 起草 单位：青 岛海 关技术 中心、东 阿阿 胶股 份有限 公司、中 国检 验检 疫科学 研究 院。本标准 主要 起草 人：张 鸿 伟、周祥 山、张晓 梅、段 小 波、张峰、郭 尚伟、田守 生、艾 连峰、梁 成珠、徐云鹏。本标准 系首 次发 布。DB37/T 4010 2020 1 含 阿胶的 食品中阿 胶含量 的测定方 法 1 范围 本标准 规定 了含 阿胶 的食 品中阿 胶含 量的 液相 色谱-质谱/质谱 测定 方法。本标准 适用 于阿 胶块、阿 胶糕、阿胶 粉中 阿胶 含量 的测定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 原理 试样中 的阿 胶经 三氯 乙酸 分离提 取，胰蛋 白酶 酶解，液相 色谱-质谱/质谱 仪 测定，外标 法定 量。4 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。4.1 阿胶 马科动 物驴Equus asinus L.的干 燥皮 或鲜 皮经 煎煮、浓缩 制成 的固 体胶。中华 人民 共和 国药 典2015 版一部，第189 页 5 试剂和 材料 除另有 规定 外，所有 试剂 均为分 析纯，水 为符 合GB/T 6682 中规 定的 一级 水。5.1 试剂 5.1.1 乙腈：色谱 纯。5.1.2 甲酸：色谱 纯。5.1.3 碳酸氢 铵：优级 纯。5.1.4 三氯乙 酸：分析 纯。5.1.5 丙酮：分析 纯。5.1.6 胰蛋白 酶：序列 分析 纯。5.2 溶液配 制 DB37/T 4010 2020 2 5.2.1 1%碳 酸氢 氨溶 液：称取 碳 酸氢铵（5.1.3）10.0 g，溶于水 并稀 释 至1 000 mL。5.2.2 30%三 氯乙 酸溶 液：准确 称取三 氯乙 酸（5.1.4）214.3 g，溶 于水 并稀 释至 500 mL。5.2.3 1 mg/mL 胰 蛋白 酶溶 液：称 取 1 mg 胰 蛋白 酶（5.1.6），用1%碳酸 氢铵 溶液1 mL 溶 解混 匀，现用现配。5.2.4 0.1%甲酸-水溶 液：取甲 酸（5.1.2）1 mL，用水 稀 释至 1 000 mL。5.2.5 0.1%甲酸-乙腈 溶液：取 甲酸（5.1.2）1 mL，用 乙 腈（5.1.1）稀 释至1 000 mL。5.3 标准品 阿胶（对照 药材）。5.4 标准储 备溶 液的 配制 准确 称取阿胶对 照药材（5.3）0.10 g，用1%碳 酸氢铵 溶 液（5.2.1）超声处理溶解，再用1%碳酸氢铵 溶液定容至 稀释至50 mL，配制成浓度 为2.0 mg/mL 的 阿胶标准储 备溶液。-20 以 下避光保存，有效期3 个月。5.5 材料 滤膜：0.22 m。6 仪器和 设备 6.1 液相色 谱-质谱/质谱 分析 仪：配 有电 喷雾 离子 源（ESI）。6.2 分析天 平：感量 为0.01 g 和0.000 01 g。6.3 高速粉 碎机。6.4 超声波 仪。6.5 离心机。6.6 涡旋混 合器。6.7 电热恒 温水 槽。7 试样制 备与 保存 7.1 试样的 制备 取出代 表性样品，固 体样品冷冻 后经粉碎机粉 碎，用四分 法缩分出不少 于5.0 g试 样，粉状样品 均分成两 份，每份 不少 于5.0 g，装 入清 洁容 器内，加 封后作 出标 记，一份 作试 样，一 份作 留样。7.2 试样的 保存 按照样 品产 品标 签规 定的 贮藏条 件保 存，未标 明贮 藏条件 的，常温 避光 保存。8 试验步 骤 8.1 试样溶 解 8.1.1 阿胶块、阿 胶粉 DB37/T 4010 2020 3 准确称 取0.1 g（精 确到0.01 g）试样，用 水超 声溶 解，再 用水 定容 至25 mL。8.1.2 阿胶糕 准确称 取5.0 g（精 确至0.01 g）试样，准 确加 入50 mL 水，超声 溶解，补 足重 量。8.2 提取 精密移 取2 mL样 品溶 液，缓 缓加入 等体 积的30%三氯 乙酸溶 液，充 分振 荡混 匀，4 静 置20 min，7 000 g离 心5 min，弃上清，用2 mL 冰浴 丙酮洗涤沉淀，7 000 g 离心5 min 后 弃丙酮 清液；再用2 mL 冰浴丙酮重复 洗涤 一次，并 挥干 丙酮，加入1%碳酸 氢铵 溶 液10 mL 20 mL 超声 至溶 解，制得 样品 阿胶 提取 液。8.3 酶解 样品阿 胶提 取液0.22 m 滤膜过 滤，取400 L 滤液，加入40 L胰 蛋白 酶溶 液，混匀，37 恒 温酶解16 h，待 测。8.4 标准工 作曲 线制 备 取标准 储备 溶液2 mL，按8.2 制得 阿胶 提取 液2 mL，过0.22 m滤 膜，分 别取 滤液50、100、200、300、400 L，用1%碳酸 氢 铵 溶 液补足 至400 L，即得 阿 胶含量 分别 为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL 标准工作 溶液，分 别加入40 L 胰蛋白酶 溶液，混 匀，37 恒温 酶解16 h，用 于制备标 准工 作曲 线。8.5 测定 8.5.1 色谱条 件 色谱参 考条 件：a)色谱柱：C18 色 谱柱（50 2.1 mm，13 m）或相 当者；b)流动相：A:0.1%甲酸-水 B:0.1%甲酸-乙腈；c)流速：0.3 mL/min；d)进样量：5 L；e)柱温：30；f)流动相 梯度 洗脱 程序 见 表1。表1 梯度洗 脱程序 时间 min A 相%B 相%0.0 95 5 1.0 95 5 4.5 70 30 5.5 70 30 5.6 5 95 6.6 5 95 6.7 95 5 8.0 95 5 DB37/T 4010 2020 4 8.5.2 质谱条 件 质谱参 考条 件：a)电离方 式：电喷 雾离 子源；b)扫描方 式：正离 子扫 描；c)检测方 式：多反 应离 子监 测（MRM）；d)喷雾电 压、离子 源温 度等 参数应 优化 至最 优灵 敏度；e)脱溶剂 气、碰撞 气均 为高 纯氮气 或其 他合 适气 体；f)监测离 子对 参数 情况 见 表2，多 反应 监测（MRM）色 谱图参 见附 录 A。表2 监测离 子对 参数 离子对 质荷比 m/z 透镜电压 V 碰撞能量 eV 定性离子对 591.8/556.3 128 22 定量离子对 591.8/910.5 128 22 8.5.3 定性测 定 在 同 样 测 试条 件 下，试 样溶 液 中 阿 胶特 征 肽的 保 留时 间 与 标 准工 作 液中 的 保留 时 间 偏 差在 2.5%以内，且离 子对 丰度 比与 浓度接 近的 标准 溶液 离子 对相对 丰度 比偏 差符 合表3 要求。表3 定性确 证时 相对 离子 丰度 的允许 偏差 相对离子丰度（%）50 2050 1020 1 0 允许的最大偏差（%）2 0 2 5 3 0 5 0 8.5.4 定量测 定 以阿胶 标准 工作 溶液 浓度 为横坐 标，以 定量 离子 对 的峰面 积为 纵坐 标，绘 制 标准工 作曲 线，按 外标法计算 试样 中阿 胶的 含量，在上 述色 谱-质谱 条件 下，阿胶 标准 工作 溶液 特征 离子质 量色 谱图 见附 录。8.6 空白试 验 除不加 试样 外，采用 完全 相同的 测定 步骤 进行 测定。9 结果计 算和 表述 试样中 阿胶 的含 量按 式（1）计算：.(1)式中：X 试样 中阿 胶的 含量，单位 为克 每百 克（g/100g）；C 从标 准曲 线得 到的 试样测 定液 中阿 胶的 浓度，单位 为毫 克每 毫升（mg/mL）；V 样品 溶液 的体 积，单位为 毫升（mL）；K 稀释 倍数；DB37/T 4010 2020 5 m 称取 试样 的质 量，单位为 克（g）。10 检测方 法的 定量 限、回收 率和精 密度 10.1 定量限 本方法 的定 量限 为0.02 mg/mL。10.2 回收率 本方法 在0.2 mg/mL 0.6 mg/mL 添 加阿 胶浓 度水 平的 回收率 为95.0%107.9%。10.3 精密度 本方 法批 内相 对标 准偏 差 15%，批 间相 对标 准偏 差20%。DB37/T 4010 2020 6 A A 附 录 A（资料 性附 录）标准工 作溶 液的 多反 应监 测（MRM）色谱 图 RT:0.00-6.000.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5Time(min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance3.24 NL:4.63E5m/z=910.00-911.00 F:+c ESI SRM ms2 591.800 556.299-556.301,910.499-910.501 MS BZ 图A.1 阿胶标 准工 作溶 液的 多反 应监测 特征 离子（591.8/910.5）质量 色谱 图（1.0 mg/mL）_