ICS 65.020.20 B 05 DB14 山西省地方标准 DB 14/T 1515 2017 食用百合 脱毒试管 苗繁育技 术规程 2017-12-10 发布 2018-02-10 实施 山 西 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB14/T 1515 2017 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 生 产设 施和 仪器 设备.2 5 培 养基.2 6 环 境消 毒和 无菌 操作.2 7 脱 毒母 株的 获取.3 8 脱 毒试 管苗 鳞茎 的诱 导 和增殖.3 9 脱 毒试 管鳞 茎生 根.4 10 脱 毒试 管鳞 茎的 移栽.4 DB14/T 1515 2017 II 前 言 本标准 按 照BG/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由山 西 农 业大 学 提 出并归 口。本标准 起草 单位：山 西农 业大学。本标准 主要 起草 人：赵娟、温银 元、尹美 强、张彬、王计 平、宋喜 娥、董淑 琦、原 向阳、王 玉国、郭平毅。DB14/T 1515 2017 1 食 用百合 脱毒试管 苗繁育 技术规程 1 范围 本标准 规定 了食用 百 合脱 毒试管 苗（鳞茎）繁 育的 生产设 施和 仪器 设备、培 养基、环境 消毒 和无 菌操作、脱毒 母株 的获 取、脱毒试 管苗 鳞茎 的诱 导和 增殖、脱毒 试管 鳞茎 生根 及 脱毒 试管 鳞茎 的移 栽。本标准 适 用 于食用 百 合脱 毒试管 苗的 繁育。2 规范性 引 用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。NY/T 1491 花 卉植 物病 毒 检测规 程 NY/T 1744 切 花百 合脱 毒 种球 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 脱毒试 管苗 在无菌 条件 下，应用 茎尖 组织培 养技 术获 得，不带LSV（百 合无 症病 毒）、CMV（黄瓜 花叶 病毒）、LMoV（百合 斑驳 病毒）病 毒的，在封 闭容 器内 繁殖 的种苗。3.2 鳞片 着生在 鳞茎 盘上 的叶 基或 者叶鞘 膨大 而成 的变 态叶。3.3 鳞茎 在短缩 茎盘 省着 生的 肉质 叶鞘膨 大而 成的 变态 器官。3.4 脱毒试 管鳞 茎 无菌条 件下，在 封闭 培育 容器内 由脱 毒试 管苗 诱导 形成的 鳞茎。3.5 DB14/T 1515 2017 2 籽球 通过组 培苗 或鳞 片繁 殖形 成的周 长小 于 3 cm 的小 鳞茎。4 生产设 施 和 仪器 设备 4.1 生产设 施 准备 室、无菌 室、培养 室、检测 室、温室 等。4.2 主要仪 器设 备 超净工 作台、压力 蒸汽 灭 菌锅、鼓风干 燥箱、光照 培养箱、人工 气候 箱、冰 箱体式 显微镜（双 筒解剖镜）、空 调、照度计、自动 控时器、温 湿度计、酶标 仪、高 速冷 冻离心 机、电 泳仪、电泳 槽、PCR仪、微 量移 液器、电 子天 平、pH 计、磁力 搅拌 器、电冰箱、移 液枪、各 种培 养容器 等。5 培养基 选用MS 培养 基（Murashige Skoog(1962)）为 基本 培 养基。5.1 MS 培 养基 母液 的配 制 按MS培 养基 标准 成分 配 制。配制 母液 时，大量 元素、微量 元素、铁 盐各 成分 依次加 热溶 解后 混合，冷却后 定容，铁盐 需装 入 棕色试 剂瓶。各母 液配 制 好后均 放置 在冰 箱中4 条件下 保存，使用 时根 据 培养基配 制 量 取适 量母 液。5.2 植物生 长调 节剂 母液 的配 制 植物生 长调节 剂配制 成浓 度为0.5 mg/mL1 mg/mL 的母液。配制 时，先 用1 mL2 mL95%乙 醇溶 解（溶解IBA、NAA）或0.1 mol/L 的HCl（溶 解6-BA、KT）溶解，再用 无菌蒸 馏水 定容至 所需 浓度，摇匀 后贮于棕 色试 剂瓶 中，置于4 冰 箱中 保存。5.3 培养基 的制 备 配制时，先 将培 养基 基本 成分（大量 元素、微 量 元 素、铁 盐、有 机物）按照 需要量 加入 量筒 中，再分 别 加 入 不同 浓 度 需 用 量的 各 种 激 素，定 容后 加 入糖 和 琼 脂，放 入 蒸煮 锅 内煮 开，用0.1 mol/L 的HCl或NaOH 调节pH值至5.65.8，分 装于 试管 或三 角瓶 等 容器 中，用 封口 膜（盖）封口，放入 高压 蒸汽 灭菌锅中 进行灭菌。灭菌时工作压 力稳定在1.1 kg/cm2（0.105 MPa），温度为121，灭菌时间20 min。灭菌后 置于 试管 架或 存放 架上冷 却待 用。6 环境消 毒和 无菌 操作 6.1 环境 消毒 接种前，提 前30 min开 启 无菌室 室内 和超 净工 作台 紫外灯 照射 消毒，关 灯后15 min 20 min工 作人员方可 进入室 内操 作。室 内若有 浮 尘，可用75%乙醇或1%苯 扎溴铵 溶液（新洁 儿灭消 毒液）喷雾 降尘。每天工 作结 束后，清扫 地 面，可用 有效 氯含 量5%6%的 次 氯酸 钠（NaClO）溶 液（84 消 毒液）500 mg/L1 000 mg/L，或将27 g/L33 g/L 苯扎 溴铵 溶液 稀释10 倍，或用50%多 菌灵400 倍 液等交 替进 行地 面消 毒。DB14/T 1515 2017 3 接种服、工 作帽、口 罩、拖鞋等 在消 毒柜 中消 毒或 用紫外 灯照 射消 毒。操作 所用的 镊子、解 剖刀、解剖针、培养 皿等 均需 用 纱布或 牛皮 纸包 裹后，经 过高压 蒸汽 灭菌，培养 皿 及滤纸 可用 牛皮 纸包 好置 于鼓风干 燥箱 内200 下灭 菌2 h。6.2 无菌 操作 工 作人 员进 入接 种室 前，需 用肥 皂清 洗手 臂，在更衣 室穿 好消 毒过 的接 种服、工作 帽、口罩 和 拖 鞋（鞋套）。操 作时 用 75%乙醇 仔细 擦拭 双 手、超 净工 作台台 面。将镊 子、接 种 刀等接 种工 具浸 泡 在 95%乙醇中，使用 前，在酒精 灯外焰 上灼烧 灭菌 后（也 可用 消 毒器代 替酒 精灯），置于搁 置架上 冷却 待用，在操作 中接 种工 具要 重复 进行灭 菌。7 脱毒母 株的 获取 7.1 外植体 选择外 观无 病毒症 状的 植 株，以 其饱满、无 病虫害、无损 伤的健 康鳞 茎为脱 毒培养 材料，取中 心茎尖为 外植 体。7.2 鳞茎灭 菌 用自来 水冲 洗鳞 茎表 面泥 土，剥 离鳞 茎外 层鳞 片，以 周长 小于1 cm 的鳞 茎为 外植体，放 入烧 杯中，移至超 净工 作台 上，先用75%乙醇（酒 精）浸泡10 s 30 s，再 用10%NaClO灭 菌处理12 min，之后 用无菌水冲 洗4 5次，再 用无 菌滤纸 吸去 表面 水分，置 于无菌 培养 皿中 备用。7.3 茎尖剥 离 将 灭过 菌 的 鳞茎 置于 40 倍 体式 显微镜（双 筒显 微镜）下，用解 剖针 由外 向内剥 去鳞 片，直至 露 出光滑的 茎尖，用 解剖 刀切 取 0.5 mm1 mm 的茎尖，接种 于 MS+6-BA 0.5 mg/L 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+3%蔗糖培养 基中，封口后，在 培养 瓶壁 上标 注编号、接 种日 期等。7.4 茎尖培 养 把 接种 后的培 养瓶放 在培养 室内的 光照培 养架 上进行 培养。培养条 件为 温度(2 52)，光照 强 度 2 000 Lx 3 000 Lx，光 照时 间 14 h 16 h/d。培养 30 40 d 后，可看 到茎 尖明显 伸长 且呈 绿色，继续培养 诱导 茎尖 萌动 成苗。7.5 试管苗 病毒 检测 随机挑 选100份 百合 茎尖 脱 毒苗，分别 用DAS-ELISA或者TR-PCR法 对其 进行LSV、CMV和LMoV 三种 病毒的检测，按 照NY/T 1744-2009中 的5.1、5.2、6.1、6.2和6.3的 规定 执行，筛 选 出无病 毒的 试管 苗。8 脱毒试 管苗 鳞茎 的诱 导和 增殖 8.1 脱毒试 管苗 鳞茎 的诱 导 病毒检 测后 获得 的脱 毒百 合 试管 苗培养30 d后，将 增 殖的芽 丛切 下，转入 鳞茎 诱导培 养基。培 养基成分为1/2MS 基本培 养基，附加NAA0.5 mg/L 1.0 mg/L，蔗糖 浓度 为60 g/L100 g/L，pH5.65.8。DB14/T 1515 2017 4 30 40 d后 分化 出小 鳞茎。培养 条件 为培 养温 度（252），光 照强 度2 000 Lx 3 000Lx，光照 时间14 h16 h/d。8.2 脱毒试管 鳞 茎扩 繁 将 诱 导 产 生 的 试管 鳞 茎 接 种 于MS+6-BA 0.2 mg/L 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 0.5 mg/L+6%10%蔗糖培养 基中，诱导 小鳞 茎增殖。培养30 40 d后，再转 接于MS+ZT 1.0 mg 3.0 mg/L+IBA 0.5 mg 1.0 mg/L+8%10%蔗 糖培 养基中，诱导 鳞茎 增 殖 膨大，获得 健壮 鳞茎，用于 生根培 养。培 养条件 同8.1。9 脱毒试 管 鳞 茎生 根 9.1 试管鳞 茎生 根 将增殖 培养获 得的 脱毒 鳞 茎接种于1/2MS+NAA 0.1 mg 0.5 mg/L+6%10%蔗 糖 培养基中，诱 导鳞茎生根。培 养条 件为 温度（222），光 照强 度2 000 Lx 3 000Lx，光 照时 间14 h 16 h/d。9.2 试管鳞 茎出 瓶标 准 试管 内生 根鳞 茎直 径达 到0.5 cm 1 cm。9.3 病毒检 测 脱毒 试管 鳞茎 的抽 样和 病 毒检测 同7.5。10 脱毒试 管鳞 茎的 移栽 10.1 炼苗 移栽前 将 达到 出瓶 标准 的 试管鳞 茎放置 于 培 养室黑 暗处10 15 d，移 栽前1周 置于温 室闭瓶 炼苗，移栽前2 3 d温 室开 瓶炼 苗。10.1 移栽基 质 移栽基质 用蛭 石、沙、土1：2：3 比 例混 合 均匀，或 用 腐叶 土、蛭石1：1比例 混合基 质，基 质厚 度10 cm 15 cm。10.2 移栽技 术 温室 移 栽时，用 清水 将试管 鳞茎 根部 的培 养基 洗干 净后，植入 移栽 基质 中，种 植密度 为100 粒/m2140 粒/m2。移栽 后，移栽 基质一 定 要 浇透 水，并在 其上 搭 建小 拱棚，覆 盖塑 料薄膜 和遮 阳网，4 周 后去遮阳网，有 新叶 长出 后，去塑料 薄膜。移 栽成 活后，可作 为脱 毒籽 球进 行田 间繁育 或直 接定 植于 大 田 栽培。5 月8 月移 栽可 直接 在大田 进行，移 栽步 骤同 上。_