ICS 67 X 04 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 5159 2019 辣椒红中 反式辣椒 红素含量 的测定 2019-12-27 发布 2020-01-28 实施 河 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB13/T 5159 2019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由邯 郸市 市场 监督 管理局 提出。本标准 起草 单位：晨光 生 物科技 集团 股份 有限 公司、河 北省 食品 检验 研究 院、河北省 标准 化协 会。本标准 主要 起草 人：杨清 山、王 红、陶晓 青、张兰 天、刘 亚玲、李 挥、季邵 东、周 丽、石文 杰、张建勇。DB13/T 5159 2019 1 辣 椒红中 反式辣椒 红素含 量的测定 1 范围 本标准 规定 了辣 椒红 中反 式辣椒 红素 的高 效液 相色 谱测定 方法。本标准 适用 于辣 椒红 中反 式辣椒 红素 的测 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 注日 期的版 本适 用于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法。3 原理 反式辣 椒红 素是 辣椒 红的 主要成 分，属于 类胡 萝卜 素类，其在 辣椒 红中 的天 然存在 状态 是反 式 辣椒红素 酯。反 式辣 椒红 素 酯经过 碱液 皂化 后，均 转 化为游 离的 反式 辣椒 红素。使 用紫 外-可见 分光 光度法测得 辣椒 红中 的总 类胡 萝卜素 含量，再 使用 高效 液相色 谱法 测得 反式 辣椒 红素在 液相 图谱 中的 面 积归一化 比例，以 总类 胡萝 卜素含 量乘 以反 式辣 椒红 素比例 得到 反式 辣椒 红素 含量。4 试剂 或 材料 除非另 有说 明，本方 法所 用试剂 均为 分析 纯，水为GB/T 6682 规 定的 二级 水。4.1 试剂 a)正己烷（C6H14）：色 谱纯；b)甲醇（CH4O）；c)无水乙 醇（C2H6O）；d)甲苯（C7H8）；e)丙酮（C3H6O）：色谱 纯；f)乙酸乙 酯（C4H8O2）：色谱 纯；g)氢氧化 钾（KOH）；h)无水硫 酸钠（Na2SO4）。4.2 试剂配 制 4.2.1 萃取剂（HEAT）：将 正己 烷、无 水乙 醇、丙酮、甲 苯按 10:6:7:7 的体 积比 例 混合摇 匀。4.2.2 40%氢 氧化 钾 甲醇 溶液（m/v）：取 氢氧 化钾 40g（精确 至0.1g）于 250mL 烧 杯中，加入 约10 mL 水迅 速用 玻璃 棒搅 拌 溶解后，加 入甲 醇50mL，搅拌至 澄清，移 入 100 mL 容量瓶 中，用甲 醇定 容、摇匀静 置待 用。其应 为无 色透明 液。DB13/T 5159 2019 2 4.2.3 10%无 水硫 酸钠 溶液（m/v）：称 量无 水硫 酸 钠 100g（精确 至0.1g）于 500mL 烧杯中，加 水溶解后转 移 到1000mL 容量 瓶 定容。4.3 对照品 辣椒红 素：（CAS:465-42-9）：对照 品，纯度 90%。4.4 标准溶 液配 制 辣椒红 素对 照品 溶液：将 适量对 照品 溶解 至25 mL 正 己烷中，用 作峰 位置 定性 使用，置于-20 冰箱保存，有 效期1年。5 仪器和 设备 a)高效液 相色 谱仪（配 备紫 外检测 器或 其他 等效 检测 器）；b)紫外-可见 分光 光度 计；c)电子天 平：感量 为 0.1 g 和0.01 mg；d)恒温水 浴锅。6 试验步骤 6.1 样品液 制备 称取0.15g（精 确至0.1mg）样品 置于50 mL 容 量瓶 中，用HEAT 定 容，摇匀 后放 在暗处 静置10min。移取5 mL 到 另一 个100mL 容 量瓶中，再 加入25 mLHEAT 和4 mL40%的氢 氧化 钾 甲 醇溶液。摇 匀后 放入25 恒温水 浴锅 静置 皂化30min。皂化 完后 加入30mL 正己 烷，用10%的无 水硫 酸钠 定 容。剧 烈摇 动2min放在暗处静 置1 h 进 行分 层（分 层后的 上层 溶液 体积 为50mL）。移取 上清 液5mL 到50mL 容量 瓶，用正 己烷 定容，得 到紫外-可见 分光 光 度计 测 试液。上 清液 过0.45 m有 机滤 膜后 用作 高效 液 相色谱 仪测 试液。6.2 测定 6.2.1 色谱参 考条 件 色谱参 考条 件如 下：a)色谱柱：硅 胶填 料，250 mm4.6mm，5m，或 性能 相当 者；b)流动相：正 己烷-丙酮-乙 酸乙酯：74+11+15（体积 比）；c)柱温：40；d)检测波 长：474 nm；e)流速：1.5mL/min；f)进样量：20L。6.2.2 测定 6.2.2.1 总类胡 萝卜 素含 量测 定 将紫外-可 见分 光光 度计 测 试液用 分光 光度 计在474 nm 处，用正 己烷 做参 比液，于1cm 比色 皿中 测定其吸 光值，吸光 度应控 制在0.30.7之 间。6.2.2.2 反式辣 椒红 素比 例测 定 DB13/T 5159 2019 3 按照参 考液 相色 谱条 件，分别检 测辣 椒红 素对 照品 溶液和 样品 高效 液相 色谱 仪测试 液，测试 液 运行时间 需大 于2 倍的 反式 辣 椒红素 保留 时间，记 录色 谱图，见附 录A。对样 品 色 谱图中 的所 有可 见峰 进行积分，以 辣椒 红素 对照 品中反 式辣 椒红 素的 保留 时间定 性，从积 分结 果中 得出样 品中 反式 辣椒 红 素的峰面 积百 分比。7 试验结 果 7.1 样品中 的 总 类胡 萝卜 素含 量 样品中 的 总 类胡 萝卜 素含 量 按公 式（1）计算。0200AVWM（1）式中：W0 样品 中总 类胡 萝卜 素的含 量，单位 为克 每千 克（g/kg）；A 样品 液在474 nm 处 测 得的吸 光值；V 样品 液的 最终 稀释 体 积，单 位为 毫升（mL）；M 称取 样品 的质 量，单 位为克（g）；200 质 量吸 收系 数，浓 度为1g/L 的 辣椒 红 素 正己 烷 溶液，使 用1cm 比 色皿，以正己 烷为 参比，在 波长474 nm下 的吸 光值，单位 为升 每克 厘米（L/g cm）。7.2 样品中 反式 辣椒 红素 含量 样品中 的反 式辣 椒红 素含量 按公 式（2）计算。P W W 0（2）式中：W 样品 中反 式辣 椒红 素 的含量，单 位为 克每 千克（g/kg）；W0 样品 中总 类胡 萝卜 素的含 量，单位 为克 每千 克（g/kg）；P 反式 辣椒 红素 在液 相 色谱图 中的 峰面 积百 分比。计算结 果以 重复 性条 件下 获得的 两次 独立 测定 结果 的算术 平均 值表 示，留三 位有效 数字。8 精密度 在重复 性条 件下 获得 的两 次独立 测试 结果 的绝 对差 值不得 超过 算术 平均 值的3%。DB13/T 5159 2019 4 A A 附 录 A（资料 性附 录）高效液 相色 谱图 A.1 辣椒红 素 对 照品 溶液 高效 液相色 谱图 见图A.1。图A.1 辣椒 红素 对照 品溶 液的液 相色 谱图 A.2 辣椒红 样品 溶液 高效 液相 色谱图 见图A.2。图A.2 辣椒 红样 品的 液相 色谱图 _