ICS 65.0 20.20 B 16 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 21802020 甘蔗黄叶病毒检测技术规程 Technical criterion for detectio n of sugarcane yellow leaf virus 2020-10-29 发布 2020-11-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 DB 45/T 2 18 0 20 20 I 前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 20标准化工作导则 第1部分：标 准化文件的 结构和起草 规则的规 定 起草。本文件由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。本文件主要起草人员：魏春燕、覃振强、韦金菊、宋修鹏、张小秋、李德伟。DB 45/T 2 18 0 20 20 1 甘蔗黄叶病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了甘蔗黄叶病毒检测技术规程的样品采集与存放，组织免疫印迹法检测和一步法RT-P CR 检测 的原理、仪器与设备、试剂、操作步骤和检测结果的判定。本文件适用于甘蔗黄叶病毒的快速检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注 日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB/T 6 68 2 20 08 分析 实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1+1 叶 t op vi si bl e de wla p le af 甘蔗植株最高可见肥厚带叶。4 样品的采集与存放 4.1 采样工具 砍刀、剪刀、镊子等采样工具应经1 21 2、1.11 0 5 P a高压灭菌1 5 mi n或经1 60 干烤2 h。4.2 采样方法 4.2.1 采样前和采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。4.2.2 甘蔗植株采样：取甘蔗植株的+1 叶，剪掉叶尾，从叶基部开始保留 15 cm 长，编号 保存备用。4.2.3 甘蔗蔗种采样：取中部种茎，编号保存备用。4.3 运送和存放 4.3.1 用于组织免疫印迹检测的样品采集后，用保温壶或保温桶加冰密封，在 2 8 条件下进行 运送；运到实验室后应在4 条件 下保存，存放应不超过 7 d。4.3.2 用于一步法 R T-PC R 检测的 样品采集后，用保温壶或保温 桶加冰密封，在 2 8 条 件下进行 运送；运到实验室后在4 条件下保存应不超过2 4 h，若需长期 保存应放置-8 0 冰箱且 避免反复冻融。DB 45/T 2 18 0 20 20 2 5 组织免疫印迹法检测 5.1 原理 将待 测的样品印迹 在固相载体硝酸纤维素膜上，用病毒的 特异 性 抗体 与 吸附在固相载体上 的病毒 进 行特异 性 反 应，再 与 碱式磷酸酶 标 记 的第 二抗体进行反 应，最后用 碱式磷酸酶 的 反 应 底物硝 基 酚磷酸片 进行显色反 应，根据颜色 的 变 化，确 定病毒的 感 染程 度。5.2 仪器与设备 5.2.1 圆周式摇床：可 调 振 荡 速 度 50 rp m 3 00 rp m。5.2.2 普 通 光 学 显微镜：放 大倍数 范 围4 0 X 1 60 0 X。5.2.3 电 子 天平：感量 0.1 g。5.2.4 硝酸纤维膜、酒精灯、手术刀、载玻片、培养皿。5.3 试剂 5.3.1 除另 有规定 外，所用试剂 均为 分析 纯 或 生 化试剂；实验室用水 符合 G B/T 66 82 的 二级 水 指 标，其中 涉 及 PC R 的用水应 符合 一 级 水 指 标；所有试剂 均 用灭菌的容器分 装，配制好 的 溶液均在 4 条 件下 保存。5.3.2 甘蔗黄叶病毒单 克隆抗体。5.3.3 碱 性 磷酸酯酶 标 二抗。5.3.4 硝 基 酚磷酸片（BC I P/N B T）。5.3.5 TB S-T 缓冲液（pH 7.5）：三羟甲 基 氨 基 甲烷盐酸盐（T r i s-H C l）1 5.7 g，氯 化 钠（N aC l）8.7 g，吐 温-2 0（T we e n-20）5 m L,用 蒸馏 水 溶解 并定容 至 1 00 0 m L，p H 调到 7.5 后 进行 高温灭菌，冷却 后保 存 备用。5.3.6 2 脱脂奶粉 的T B S-T 封闭 液：称 取2 g 脱脂奶粉 用1 0 0 m L TB S-T 缓冲液配 制 成2 脱脂 奶粉 的 TB S-T 封闭液，现配现 用。5.3.7 1 脱脂奶粉 的T B S-T 缓冲 液：称 取1 g 脱脂奶粉 用5 0 m L TB S-T 缓冲液配制 成2 脱脂奶 粉 的 TB S-T 封闭液，现配现 用。5.3.8 标准样品：阳 性对照：用 已知含 甘蔗黄叶病毒的样品作 阳 性对照；阴 性对照：用 已知 不 含 甘蔗黄叶病毒的样品作 阴 性对照。5.4 操作步骤 5.4.1 样品制备 从 4 冰箱 中取 出 材料，用 7 5 酒精 进行 叶 片表面消 毒，选 取叶中 脉，用 经 火焰消 毒的 解剖 刀 切 叶 中 脉 并 把 新 鲜切 口 垂直 印 在硝酸纤维膜上，保 持 5 s 6 s至 硝酸纤维膜 出 现清晰完整 的印迹，每个 样品 3 次重 复 印迹，印 好 的 膜在 室温下自 然风 干10 mi n 15 mi n后 置 于 4 冰箱 保 存备用。5.4.2 操作流程 5.4.2.1 封闭 将 印 好 的 硝酸纤维膜置 于 盛 有2 脱 脂奶粉 的TB S-T 封闭液 的 培养皿 中，封闭液 的用 量以覆盖硝酸纤 维膜为宜，置培养皿 于 转 速 为 50 rp m的 水 平摇床，室温下 孵育4 0 mi n 60 mi n。DB 45/T 2 18 0 20 20 3 5.4.2.2 第一次洗涤 用TB S-T 缓冲 液洗膜3次，每次5 m in，该过程 在50 rp m的水平摇 床上进行，保 证膜可以完全洗脱干净。5.4.2.3 第一次孵育 将清洗 后的 膜转入含有1 脱脂奶粉 的T B S-T 缓冲液的 培养皿中，同时在缓冲液中 加入特异 性 抗体（抗体稀释比例为1:7 0 0 0），在室温 下孵育3 h或 4 静置过夜，室温孵育时在转速为50 rp m的水平摇 床上进行。5.4.2.4 第二次洗涤 同5.4.2.2。5.4.2.5 第二次孵育 将清洗后的膜转入含有1 脱脂奶粉的TB S-T 缓冲 液的培养皿中，同时在缓冲液中加入含有碱式磷酸 酶 标 记 的 二抗（抗体稀释比例为1:2 0 0 0），在 室温 下 孵育3 h，孵育时在转速 为 50 rp m的 水 平摇床上 进行。5.4.2.6 第三次洗涤 同5.4.2.2。5.4.2.7 显色和终止 将清洗后的 膜转入显色 液（每片硝 基 酚磷酸片 溶于1 0 m L蒸馏水）中，在 5 mi n 10 min 内 观察，待 阳性对照显示清晰的紫蓝色时，将膜转入蒸馏水中使之终止反应。5.5 检测结果的判定 5.5.1 判定依据 检测过程中分别设定阳性对照和阴性对照。用已知含有甘蔗黄叶病毒的样品作阳性对照，用已知不 含甘蔗黄叶病毒的样品作阴性对照，判定依据如下：阴性对照：样品印迹在膜上未显示有任何紫蓝色；阳性对照：样品印迹在膜上显示有清晰的蓝紫色。5.5.2 阴性 样品印迹在膜上未显示有任何紫蓝色，表示样品中不含甘蔗黄叶病毒。5.5.3 阳性 样品印迹在膜上显示有清晰的蓝紫色，表示样品中含甘蔗黄叶病毒。6 一步法 R T-PCR 检测 DB 45/T 2 18 0 20 20 4 6.1 原理 经 反转录酶 的作用从R NA合 成c DNA，再以 c DNA为 模板，扩增 合 成 目 的 片段。RT-PCR 可 以 一步法 或 两 步法的 形式进行。一步法RT-P CR中，反转录 和P CR 在同时为 反转录 和 P CR的 优 化条件下，在同 一 支管 中 顺 次 进行。6.2 仪器与设备 6.2.1 普 通 P CR 仪。6.2.2 电 子 天平：感量 0.01 g。6.2.3 高速 台式冰冻离心机：最 大离心力 15 00 0 g。6.2.4 组织研 磨 仪。6.2.5 水 平电泳系统。6.2.6 凝胶 成 像系统。6.2.7 微量移液 器：0.1 L 2.5 L，0.5 L 10 L，1 0 L 100 L，1 0 L 200 L，1 00 L 1 00 0 L。6.2.8 无 R NA 酶 的 离心管、PC R 反 应 管、硝酸纤维膜、手术刀、载玻片、酒精灯。6.2.9 冰箱：2 4，-20，-8 0。6.3 试剂 6.3.1 植 物 R NA 提 取试剂 盒。6.3.2 一步法 RT-P C R 扩增 试剂 盒。6.3.3 DN A 分子 量 标准 物（100 bp 2 00 0 bp）。6.3.4 DN A 凝胶加 样 缓冲液（6 DN A Lo a d in g B uf fe r）。6.3.5 检测引 物:上游 引 物S C YL Vf 1：5-G A C A G A CT CG GC C A GT GG TC GT G-3；下 游 引 物S C YL Vr 1：5-G T AA GC C A TT GT TG AA CG CT GC G-3；扩增片段大 小 为 21 9 bp。6.3.6 50 T A E 缓冲 液:取 三羟甲 基 氨 基 甲烷（T r i s）2 4 2.2 g，先 用 3 00 m L蒸 馏 水 加 热搅拌 溶解 后，加 100 m L 5 00 m M/L 乙 二 胺四乙 酸（ED T A）的水 溶液（pH 8.0），用 冰 乙 酸调 p H 至 8.0，用 蒸馏 水定 容 到 1 00 0 m L。6.3.7 1T AE 缓冲 液:取 5 0T A E 缓冲液 储 液直 接 用 蒸馏 水 进行 50 倍稀 释 即得 到 1 T A E 缓冲液，现 配现 用。6.3.8 标准样品:同 5.3.7。6.4 操作步骤 6.4.1 总 R NA 的提取。6.4.1.1 取与组织研 磨 仪 配 套 使 用 且 内 含 滚珠 的2 m L无 R N A 酶离心管，并对 每个管进行 编号。6.4.1.2 取出 冰箱 中存放的样品 材料 剪 碎混匀 后 称 取1 g 样品（蔗茎样品要 去 除表 皮）转至离心管，并 加入 0.9 m L 提取试剂 盒 中 配 备的 R NA 提取 液。6.4.1.3 将离心管置 于组织研 磨 仪 上 震 荡粉 碎 2 m in，取 出 离心管 并 置 于 4、1 2 00 0 g离 心 10 m in。6.4.1.4 吸 取 上清液至另 一不 含 滚珠 的新 2 m L无 R N A 酶离 心管，并按照 R NA 提取 试剂 盒 推荐 的操作方 法 完 成R NA 的提取，提取 完 成的 R NA 置 于 冰上 保 存备用。提取的 R NA 应 在 2 h内 进行 RT-P C R 扩增；若 需 长期保存，应放 置-8 0 冰箱。DB 45/T 2 18 0 20 20 5 6.4.2 反转录及 P CR 反应 6.4.2.1 以样品、阴性和阳性对照总 RNA 为模 板，并以超纯水为空白对照模板；选用一步法 RT-P CR 试剂盒在同一P C R反应 管内进行反转录和P C R 扩增，具体步骤按照试剂盒推荐的操作方法进行。6.4.2.2 从试剂盒中取出 RT-P C R 反应液，在冰上融化后，2 00 0 g离 心5 s。每个 测试样本反应混合液 配制参见表 1。表1 每个测试样本反应混合液配制的组分及使用量 试剂 使用量 25L反应体系终浓度 5反应缓存液 5.00 L 1 10 mmol/L dNTPs 0.50 L 0.2 mmol/L SCYLVf1（10 M）1.00 L 0.4 mol/L SCYLVr1（10 M）1.00 L 0.4 mol/L 10 U/L RNAas e 抑制剂 0.25 L 2.5 U/25 L DEPC水 15.25 L/RT-PCR Mix 1.00 L/模板RNA 1.00 L/总体积 25 L/6.4.2.3 根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，全部加完后，充分混合均匀，2 00 0 g离 心 5 s，向每个做好标记的P C R 管中各分装 2 4.0 L。6.4.2.4 向各个标记好的P C R管 中分别加入 1.0 LR NA 模板，盖紧管盖后，轻微混匀，5 0 0 g离 心3 0 s。6.4.2.5 将加样后的 P CR 管放 入 P C R 仪内，设定 好 PC R 反应 条件后开始程序。PC R 反 应程序为：5 0 进行 cDNA 合成 30 m in；9 5 预变性5 m in；进行 3 5次 扩增循环（94 变性1 m in，7 1 退 火 1 mi n,7 2 延伸 30 s）；72 延伸 10 mi n。反应程 序结束后，取出 PC R 反应管并在4 条件下保存。6.4.3 扩增产物的电泳检测 6.4.3.1 称取适量琼脂糖加入 1 T AE 缓冲液中，加热至完全溶解，配制成1.5 的 琼脂糖溶液；稍适 冷却后倒板，室温下凝固成琼脂糖凝胶。6.4.3.2 分别取2 L 的 6上样缓冲 液 和5 L 的P C R扩增 产物到新的 P CR 管，振荡 混匀，2 00 0 g离 心5 s。6.4.3.3 分别将 5 L 的 DNA 分子量 标准物和 PCR 产物混合液依次加入琼脂糖凝胶的点样孔后进行电泳，电泳使用的电压为 80 V，电泳时间为3 0 mi n。6.4.4 凝胶成像分析 将琼脂糖凝胶 置 于凝胶 成像系统成 像仪，根据DNA分子量标准物判断扩增 出的目的条 带 大小，将电 泳结果用拍照系统拍照形成图片文件存档。6.5 检测结果的判定 DB 45/T 2 18 0 20 20 6 6.5.1 判定依据 检测过程中分 别 设定 阳 性对照、阴 性对照和 空白 对照。用 已知含 有甘蔗黄叶病毒的样品作 阳 性对照；用 已知 不 含 甘蔗黄叶病 毒的样品作 阴 性对照；用等 体 积 的 无 R NA酶 的水 代替 模板 作 空白 对照，判定 依据 如 下：空白 对照：无任何目 的 扩增 条带；阴 性对照：无 21 9 bp 大 小的 目 的 扩增 条带；阳 性对照：出 现 单一的 2 1 9 bp 大 小的 目 的 扩增 条带。6.5.2 阴性 无 21 9 bp 大 小的 目 的 扩增 条带，表示 样品中不 含 甘蔗黄叶病毒。6.5.3 阳性 出 现 单一的2 1 9 bp大 小的 目 的 扩增 条带，表示 样品中 含 甘蔗黄叶病毒。6.5.4 有效原则 如 果 空白 对照或 阴 性对照 任何 一 个 出 现 21 9 bp大 小的 目 的 扩增 条带，或 阳 性对照 未 出 现任何 21 9 bp大 小的 目 的 扩增 条带，以上 情况 出 现任何 一种，本次实验结果 均 视 为无 效，所有样品 均 应重 做。中华人民共和国广西地方标准 甘蔗黄叶病毒检测技术规程 DB 45/T 2180 2020 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究