ICS 65.0 20 B 34 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 20282019 甘蔗组织培养污染控制操作规程 Technical regulations for aseptic operation procedure of sugarcane tissue culture 2019-12-05 发布 2019-12-30 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布 DB 45/T 2 02 8 20 19 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 术语和定 义.1 3 甘蔗组织 培养消毒灭菌.1 4 接种转管 消毒灭菌.2 5 培养室日 常清洁和消毒管理.4 6 污染培养 容器清洗处理.4 7 建立档案.4 DB 45/T 2 02 8 20 19 III 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区糖业生产办公室提出并宣贯监督。本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所。本标准主要起草人：李松、刘红坚、卢曼曼、刘俊仙、刘丽敏、张荣华、余坤兴、何毅波、刘欣、张伟珍。DB 45/T 2 02 8 20 19 1 甘蔗组织培养污染控制操作规程 1 范围 本标准规定了甘蔗组织培养污染控制的术语和定义、甘蔗组织培养消毒灭菌、接种转管消毒灭菌、培养室日常清洁和消毒管理、污染培养容器清洗、建立档案。本标准适用于甘蔗组织培养污染控制。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 内源性污染 en do ge no us po ll ut io n 外植体内部所带细菌或真菌等微生物所造成的污染。2.2 外源性污染 ex og en ou s p ol lu ti on 人为操作不当以及环境因素所引起的污染。2.3 接种 v ac cin at e 外植体经消毒灭菌处理后接入到有新鲜培养基的培养容器中的过程。2.4 转管 t ub e t ra ne fe r 组织培 养材料从原培养容器转移到有新鲜培养基的培养容器中的过程。3 甘蔗组织培养消毒灭菌 3.1 培养基灭菌 3.1.1 培养基采用高压蒸汽灭菌器进行高温高压湿热灭菌。3.1.2 灭菌程序及安全操作技术按高压蒸汽灭菌容器操作说明进行。3.1.3 在压力 0.11 MP a 或 0.1 4 M Pa、温度 12 1 条件下保 持灭菌时间 2 0 mi n 3 0 min。3.1.4 经过灭菌处理的培养基在储藏室放置 5 d 7 d 后，污染率 5.0。DB 45/T 2 02 8 20 19 2 3.2 接种室清洁、消毒 3.2.1 操作使用前 3.2.1.1 先用吸尘设备吸干净接种室地面尘埃，再用湿拖把拖擦 1 2 遍。3.2.1.2 打开接种室紫外灯 30 mi n 以上，同步 开启臭氧发生器。3.2.1.3 关闭紫外灯及臭氧消毒机 30 mi n 后，工 作人员进入接种室进行操作。3.2.2 操作结束后 3.2.2.1 吸尘设备吸尘后用 0.1 0.2 苯扎 溴铵溶液 擦 拭 地 板 1 2 遍。3.2.2.2 打开紫外灯或臭氧发生器 1 h 2 h。3.3 工作人员的清洁和消毒 3.3.1 进入接种室前，先用洗 手液 和自 来水 洗净 双手，后 更换专 用 鞋子、穿工 作 服、戴帽子 和口 罩。3.3.2 用7 5 乙醇 溶液 擦 拭 所 戴手套 或 双手。3.3.3 操作 结束 后，在 缓冲 间 脱 下 专 用 工 作 服、帽子 和口 罩，放 回 原位；离 开 缓冲 间 换 下 专 用 鞋子。3.4 工作人员用品的清洁和消毒 3.4.1 工 作 服、帽子、专 用 鞋子、口 罩 等，1 d 2 d 清洗、替换 1 次。3.4.2 使 用过的 工 作 服、帽子 等，每周 和培养基 一 起高压灭菌 1 次。3.5 超净工作台的消毒 3.5.1 先开 超 净 工 作 台 的紫外灯 30 mi n，后开 风 机30 mi n 以上。3.5.2 对超 净 工 作 台 的 顶 部、左右壁 及 台 面、接种转管用 具、灭菌器 表 面等用 75的 乙 醇溶液 进行 喷 雾 消毒。3.5.3 转管 工 作 结束 后，先开启紫外灯 30 mi n 后关闭 风 机，再关紫外灯。3.6 接种转管工具的消毒灭菌 3.6.1 每天 接种转管所用的 剪刀、镊子、刀子 等 工具，与 培养基 一 起在高压蒸汽灭菌器内进行高温高 压湿热灭菌 1 次。3.6.2 已 灭菌的接种转管 工具 不 得与未 灭菌培养 瓶 或物 品混 放。3.6.3 转管前,将 3.6.1 灭菌的接 种转管 工具 用 75的 乙 醇溶液 擦 拭，然 后在 25 0 以上的 专 用 电 热 灭菌器中灭菌 30 s 以上。3.6.4 每 接种转管 1 次，所 使 用的 工具 置于 盛 有 75的 乙醇溶液瓶 中 浸 洗，按 3.6.3 方法 进 行高温 灭 菌备用。3.6.5 操作 工 作 结束 后，所有 使 用过的 剪刀、镊子、刀子 等 工具，先用自 来水 清洗干净，再按 3.6.1 方法 进行消毒灭菌。4 接种转管消毒灭菌 4.1 外植体的选取和预处理 4.1.1 在甘蔗生 长旺盛期，选择 生 长健 壮、无病虫害、具 有本 品 种 典型特征 的 健康 新植蔗植 株 的 侧芽、幼嫩叶鞘 等器 官 或组织。DB 45/T 2 02 8 20 19 3 4.1.2 连续晴天 3 d 5 d，并在 早上露水干后采集外植体。4.1.3 在田间对甘蔗植株下部离地面以上 1 5 c m 2 0 cm 处、上部从+1 叶肥厚带以下 2 c m 3 c m处 砍 下，去叶片，保留完整的叶鞘，放在干净容器中带回实验室。4.1.4 用干净毛巾擦拭外植体表面2 3 次，后用 75 的乙醇溶液擦拭表面1 2次。4.2 接种的消毒灭菌 4.2.1 叶鞘幼嫩组织 4.2.1.1 取带有1 2 个嫩节的鞘部，用 75 的乙醇溶液擦拭表面1 次，放入超净工作台。4.2.1.2 剥去外层老叶鞘，每剥一层叶鞘更换一次灭过菌的刀片。4.2.1.3 内部幼嫩组织诱导培养产生胚性细胞团。4.2.1.4 诱导培养污染率 5.0 7.0。4.2.2 腋芽 4.2.2.1 剥去蔗茎叶鞘，用 75 的乙醇溶液擦拭表面1 次，用 刀片将腋芽从蔗段中剥离，自 来水冲洗 20 mi n 3 0 m in。4.2.2.2 在超净工作台上将预处理过的腋芽，放 入 无菌的容器中，倒入 75的乙 醇溶液浸泡 10 s 30 s，将乙醇倾 去，用无菌水冲洗2 3 次。4.2.2.3 用1.0 2.0的次氯 酸钠溶液浸泡 10 mi n 15 m in，处理过 程中要不断轻摇；倒出灭菌液，用无菌水冲洗3 5次后 备用。4.2.2.4 腋芽分化培养产生丛生小苗。4.2.2.5 分化培养污染率 5.0 10.0。4.2.3 茎尖 4.2.3.1 单芽蔗茎在3 8 4 0 条件下培养 1 0 d 2 0 d，取健壮蔗芽苗，用自来水冲洗干净，从蔗 段剥离芽苗，再用 75 乙醇溶液擦拭表面2次 后带入接种室；4.2.3.2 在超净工作台内先用 75 乙醇溶液浸泡芽苗材料 10 s 3 0 s 后，再用 1.0 2.0 的 次氯 酸钠溶液浸泡 10 mi n 15 mi n；倒出灭 菌 液，用无菌水冲洗2 3 次。4.2.3.3 剥去蔗芽外层叶鞘，取茎尖组织。每剥一层叶鞘更换一次灭过菌的刀片或接种针。4.2.3.4 茎尖分化培养产生丛生小苗。4.2.3.5 茎尖分化培养污染率 4.0 6.0。4.3 转管 4.3.1 转管前对污染或疑似污染的材料一律去除。4.3.2 准备转管的材料，用 75 的乙醇溶液擦拭培养容器表面1 次。4.3.3 培养基、准备进行转管的材料及包扎灭菌好的其他物品，应在超净工作台内开启。4.3.4 在操作区内，每次不宜放入过多的待用培养基和材料。4.3.5 打开培养容器时，应拿成斜角，以避免尘埃落入培养容器中；培养容器口与送风的流动方向平 行。4.3.6 每转管 1 次，转管工具按3.6方法 灭菌放凉后备用。4.3.7 每次转完超净工作台内材料后，用 7 5的乙醇溶 液消毒双手和工作台面。4.3.8 转管材料污染率 3.0 5.0。DB 45/T 2 02 8 20 19 4 5 培养室日常清洁和消毒管理 5.1 湿度控制 应 用 空调、空气抽 湿机等 对 培养室的 空气 湿度控制在50.0 60.0。5.2 日常消毒 当 天工 作 结束 后用 溴 氧发生器进行 溴 氧消毒1 h 2 h。5.3 除尘 每周 定 期 用 除 尘器 对 培养室的地 板 吸尘23 次，以 减少 环境 灰 尘 累积。5.4 污染苗清理 每天对 组培材料进行 观察，发 现 污染的 应 立 即 移出培养室。5.5 培养架清洁 每批次 培养材料转接移开培养 架 后，应 立 即 清 除 培养 架 上的 灰 尘及 渗 出的培养基，用75的 乙醇 进 行擦 拭 1 次。6 污染培养容器清洗处理 6.1 污染材料处理 从培养室移出的污染材料在培养容器 盖未 打开前，先进行高温灭菌，再进行清洗。6.2 清洗地点选择 应选 在组培 实验楼 外 且 处于下 风 口的地 方。6.3 培养容器清洗 打开经过灭菌处理的培养容器，倒 出污染材料并 集 中处理，培养容器及 盖子 用2洗 衣 粉液浸泡 0.5 h 1.0 h，将 污染物洗 除 干净，再用自 来水冲 洗2 次。7 建立档案 记录好 外植体转接 完 成时间、数量、品 种、接种人、培养基、污染材料、褐死 材料等技术 资 料。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 甘蔗组织培养污染控制操作规程 DB45/T 2028 2019 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究