ICS 07.080 CCS A 40 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2026 2020 骆驼源性 成分检测 方法 实时荧光PCR 法 Real-time PCR Method for Authentification of Camel Derived Materials 2020-10-20 发布 2020-11-20 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 2026 2020 I 前 言 GB/T 1.1-2020 1 SAM/TC 39 DB15/T 2026 2020 1 骆 驼源性 成分检测 方法 实时 荧光 PCR 法 1 范围 PCR 0.1%5%2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB/T 27403 3 术语和 定义 3.1 实时荧 光PCR real time PCR PCR PCR 3.2 Ct 值 cycle threshold 3.3 阳性对 照 positive control 3.4 阴性对 照 negative control DB15/T 2026 2020 2 3.5 空白对 照 blank control DNA 4 原理 PCR DNA Ct 5 试剂和 材料 GB/T 6682 5.1 5.2 5.3 5.4 95%5.5 75%5.6 CTAB 10 g CTAB 40.6 g NaCl 6.06 g Tris base 3.94 g Na2EDTA 800 mL HCl pH 8.0 1000 mL 121 30 min 2%-5.7 20 mL Triton X-100 90%125 mL 95%855 mL NaCl 0.9 g/L 1000 mL 121 30 min 5.8 PBS 8 g NaCl 0.2 g KCl 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 800 mL HCl pH 7.4 1000 mL 121 30 min 5.9 PCR 1 U 2 U Taq 1 PCR 2.5 mmol/L 4.0 mmol/L Mg2+0.2 U 1 U UNG 0.2 mmol/L dNTP 5.10 1 表1 引物和 探针 序列/TTGAACTAGGCCATGRAGC 12S rRNA/120 bp CTTACCTTGTTACGACTTRTCTC HEX-TTCTCATACGTTTTGCACTTATTTAT-MGB DB15/T 2026 2020 3 表1/ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2 注：10 mol/L R G/A 6 仪器和 设备 6.1 PCR 3 0.1 6.2 6.3 12000 g 6.4 0.5 L 10 L 10 L 100 L 20 L 200 L 100 L 1000 L 6.5 0.5 6.6 pH 0.01 6.7 6.8 6.9 0.1 g 0.0001 g 6.10 6.11 7 分析步 骤 7.1 样品制 备-7.2 DNA 提取 7.2.1 鲜肉及 肉乳 制品 样品（固 态）100 mg 1.5 mL 700 L CTAB 5.6 30 min 5 min 13000 rpm 5 min 24:1 13000 rpm 5 min 13000 rpm 5 min 75%13000 rpm 30 s 20 L 50 L-20 DNA DB15/T 2026 2020 4 7.2.2 鲜乳及 乳制 品样 品（液态）50 mL 50 mL 7500 rpm 30 min 600 L PBS 5.8 1.5 mL 13000 rpm 10 min 60 L 5.7 540 L PBS 5.8 10 min 13000 rpm 10 min 500 L PBS 5.8 13000 rpm 10 min 7.2.1 DNA 7.2.3 DNA 浓 度和 纯度 的测 定 260 nm 280 nm A260 A280 1 DNA DNA DNA 10 ng/L 100 ng/L A260/A280 1.7 2.1 PCR 100 ng/L 10 ng/L 1.7 DNA c=A N 50/1 c DNA g/L A 260 nm N 7.3 实时荧 光PCR 检测 7.3.1 实时荧 光PCR 反 应体 系 PCR 2 表2 实时荧 光PCR 反 应体 系 PCR 10.0 10 mol/L 1.0 10 mol/L 1.0 10 mol/L 0.5 10 mol/L 0.5 DNA 10 ng/L 100 ng/L 1.0 6.0 20.0 注：PCR 7.3.2 实时荧 光PCR 反 应程 序 DB15/T 2026 2020 5 94 30 s 1 94 5 s 60 31 s 40 60 PCR 8 质量控 制 a)Ct 40.0 b)Ct 40.0 Ct 30.0 c)Ct 30.0 d)9 结果判 定与 表述 9.1 结果判 定 8 a)Ct 35.0 Ct 35.0 b)Ct Ct 35.0 c)35.0 Ct 40.0 Ct.0 Ct 40.0 Ct.0 9.2 结果表 述 9.2.1 9.2.2 10 检测过 程中 防止 交叉 污染 的措 施 GB/T 27403 D DB15/T 2026 2020 6 A A 附 录 A（资料 性）目的基 因扩 增靶 标参 考序 列 A.1 骆驼特 异性 基因 实时 荧光PCR扩增 产物 核苷 酸序 列（120 bp）及 引物 和 探 针位 置 TTGAACTAGGCCATG(G/A)AGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCTTCAAATCCAATGAGCCCGCAAGAAAATATAAATAAGTGCAAAACGTATGAGAAGAGA(T/C)AAGTCGTAACAAGGTAAG 注：