ICS 13.020.40 Z 10 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3286 2020 水质 5 种磺胺类抗 生素的测 定 固相萃取/高效液相 色 谱-三重 四极杆串 联质谱法 2020-08-30 发布 2020-09-30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB21/T 3286 2020 I 目 次 前 言.II 1 适用范围.1 2 规范性引用文件.1 3 方法原理.1 4 干扰和消除.1 5 试剂.1 6 仪器和设备.2 7 样品.2 8 分析步骤.3 9 结果计算与表示.5 10 精密度和准确度.6 11 质量保证和质量控制.7 12 废物处理.7 附录 A（资料性附录）方法的精密度和准确度.8 DB21/T 3286 2020 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准附录A为资料性附录。本标准由大连市市场监督管理局提出。本标准由辽宁省生态环境厅归口。本标准主要起草单位：辽宁省大连生态环境监测中心。本标准主要起草人：付晓燕、刘莲莲、杨硕、杨萌。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省生态环境厅（沈阳市浑南区双园路30甲），联系电话：024-62788517。标准起草单位通讯地址：辽宁省大连生态环境监测中心（辽宁省大连市沙河口区连山街58号），联系电话：0411-84691900。DB21/T 3286 2020 1 水质 5 种 磺胺类 抗生素 的测 定 固 相萃取/高效液相 色谱-三重四 极杆 串联质 谱法 警告：实验 中所 使用 的甲 醇、磺 胺类 抗生 素属 于有 毒有机 物，实验 操作 时应 避免接 触皮 肤和 衣 物，溶液配 制过 程应 在通 风橱 内进行。1 适用范 围 本标准规定了测定水中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑等5种磺胺类抗生素的高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法。本标准适用于地表水、地下水、海水、工业废水和生活污水中5 种磺胺类抗生素的测定。当样品体积为100 ml，浓缩定容至1.0 ml，进样体积为10.0 l时，本方法磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑的检出限分别为0.01 g/L、0.01 g/L、0.01 g/L、0.009 g/L和0.01 g/L，测定下限分别为0.04 g/L、0.04 g/L、0.04 g/L、0.036 g/L和0.04 g/L，测定上限均为100 g/L。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ 91.1 污水监测技术规范（部分代替HJ/T 91 污水监测技术规范）HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ/T 164 地下水环境监测技术规范 HJ 442 近岸海域环境监测规范 HJ 493 水质 样品的保存和管理技术规定 3 方法原 理 水样经固相萃取后，水中磺胺类抗生素经液相色谱仪分离，用串联质谱仪在多反应监测（MRM）条件下测定，根据保留时间和特征离子对定性，内标法以峰面积（或峰高）定量。4 干扰和 消除 当样品中存在基质干扰时，可通过优化色谱条件、稀释样品、减少进样体积以及对样品进行预处理等方式降低或消除。5 试剂 DB21/T 3286 2020 2 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的优级纯试剂，实验用水符合 GB/T 6682，一级。5.1 甲醇（CH3OH）：液相色谱纯。5.2 甲酸（HCOOH）。5.3 甲酸溶液：1+1000（V/V）。量取1.0 ml甲酸（5.2）缓慢加入1 L实验用水中，混匀。5.4 标准物质 5.4.1 磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑标准物质：纯度99%。5.4.2 磺胺甲基嘧啶-13C6内标标准物质：纯度99%。5.5 标准溶液 5.5.1 磺胺类抗生素标准贮备液：=100.0 mg/L。准确称取适量的每种磺胺类标准物质（5.4.1），用甲醇配成100.0 mg/L的标准贮备液，或直接购买有证标准溶液，贮备液在04冷藏避光保存，可稳定保存20天，或参照制造商的产品说明保存。5.5.2 磺胺类抗生素标准使用液：=1.00 mg/L。将磺胺类抗生素标准贮备溶液（5.5.1）用甲醇稀释至1.0 mg/L，现用现配。5.5.3 磺胺甲基嘧啶-13C6标准贮备液：=100.0 mg/L。准确称取适量的磺胺甲基嘧啶-13C6标准物质（5.4.2），用甲醇（5.1）配成100.0 mg/L的标准贮备液，或直接购买有证标准溶液，贮备液在04冷藏避光保存或参照制造商的产品说明保存使用。5.5.4 磺胺甲基嘧啶-13C6标准使用液：=1.0 mg/L。将磺胺甲基嘧啶-13C6标准贮备溶液（5.5.3）用甲醇（5.1）稀释至1.0 mg/L，现用现配。5.6 氮气：纯度99.9%。6 仪器和 设备 6.1 高效液相色谱/三重四极杆质谱仪：高效液相色谱仪具备梯度洗脱功能；三重四极杆质谱仪配有电喷雾离子化源（ESI）。6.2 色谱柱：填料为硅胶基质C18，粒径1.8 m，柱长100 mm，内径2.1 mm，或其他等效色谱柱。6.3 固相萃取装置。6.4 浓缩装置：K-D浓缩器、氮吹仪等性能相当的设备。6.5 滤膜：针式有机相过滤器，孔径0.22 m，直径13 mm，玻璃纤维、亲水性聚丙烯、亲水性聚四氟乙烯（PTFE）或其它等效材质。6.6 固相萃取柱：填料为二乙烯苯和 N-乙烯基吡咯烷酮共聚物或同等柱效的萃取柱，规格为 6 ml/500 mg。6.7 棕色样品瓶：2.0 ml。6.8 采样瓶：500 ml棕色玻璃瓶，螺旋盖（具聚四氟乙烯涂层的密封垫）。6.9 微量注射器：10 l、50 l、100 l、1 ml。7 样品 7.1 样品采 集与 保存 DB21/T 3286 2020 3 按照GB/T 14581、HJ 91.1、HJ/T 91、HJ/T 164、HJ 442和HJ 493的相关规定进行样品的采集和保存。采集样品时，向采样瓶（6.8）中加入甲酸（5.2）500 l，然后采集样品至满瓶，拧紧螺旋盖密封，摇匀。水样04冷藏避光保存，48 h内完成分析。7.2 试样制 备 活化：用10 ml甲醇（5.1）活化固相萃取柱，保证固相萃取柱柱头浸润。再用10 ml实验用水活化固相萃取柱，保证固相萃取柱柱头浸润。上样：水样上样前放置至室温，准确量取100 ml水样，水样以35 ml/min的流速通过固相萃取柱。淋洗：用10 ml实验用水淋洗固相萃取柱，将在固相萃取柱上保留较弱的杂质淋洗下来，弃去淋洗液。洗脱：用10 ml甲醇（5.1）洗脱富集后的固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脱液。浓缩：将上述提取溶液浓缩至低于1.0 ml近干，加甲酸溶液（5.3）定容到1.0 ml，最后加入内标使用液10.0 l，经0.22 m滤膜（6.5）过滤，置于棕色样品瓶（6.7）中，待测定。7.3 空白试 样的 制备 用实验用水代替样品按照试样制备（7.2）相同操作步骤，制备空白试样。8 分析步 骤 8.1 仪器参 考条 件 8.1.1 液相色 谱仪 参考 条件 流动相：流动相A为甲醇（5.1），流动相B为甲酸溶液（5.3），线性梯度洗脱程序见表1。柱温：40；进样体积：10 l；流速：0.2 ml/min；表1 液 相色 谱流 动相 线性 梯度洗 脱程 序 时间（min）流动相 A（%）流动相 B（%）0 5 95 0.5 5 95 5.0 30 70 7.0 30 70 7.5 90 10 8.5 90 10 9.0 5 95 10.0 5 95 8.1.2 质谱仪 参考 条件 DB21/T 3286 2020 4 正离子模式（ESI+）；离子化电压：3000 V；离子源温度：120；检测方式：MRM，多反应监测条件见表2。表2 目标 化 合物 的多 反应 监测条件 目标化合物 检测离子对（m/z）驻留时间（ms）锥孔电压（V）碰撞电压（V）磺胺嘧啶 251.092.0*20 30 30 251.0156.0 15 磺胺甲基嘧啶 265.1156.1 20 35 28 265.1108.1*16 磺胺二甲嘧啶 279.192.2*20 30 28 279.1186.1 15 磺胺间甲氧嘧啶 281.192.1*20 30 28 281.1156.1 15 磺胺甲恶唑 254.092.2*20 30 30 254.0156.2 20 磺胺甲基嘧啶-13C6 271.0162.0*20 35 28 注：带*的为定量离子对 8.2 校准 8.2.1 校准曲 线的 建立 取一定量磺胺类抗生素标准使用液（5.5.2）于甲酸（5.3）水溶液中，制备至少5个浓度点的标准系列，磺胺类抗生素的质量浓度分别为4.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、50.0 g/L和100 g/L，每毫升标准系列溶液中加入10.0 l内标使用液（5.5.4），贮存在棕色样品瓶（6.7）中。将标准系列溶液按浓度由低到高的顺序依次进样，以标准系列溶液中磺胺类抗生素的质量浓度为横坐标，磺胺类抗生素的峰面积（或峰高）与内标物的峰面积（或峰高）比值和内标物浓度的乘积为纵坐标，绘制校准曲线。8.2.2 标准样 品谱 图 磺胺类抗生素和内标物的总离子流图，见图1。DB21/T 3286 2020 5 图1 磺 胺类 抗生 素 和 内标 物的总 离子 流图（注：1：磺胺 嘧啶、2：磺胺甲 基嘧 啶、3：磺胺 甲 基嘧啶-13C6、4：磺胺 二甲 嘧啶、5：磺胺 间甲 氧 嘧啶、6：磺胺 甲 恶唑）8.3 测定 8.3.1 试样测 定 按照与校准曲线的建立（8.1）相同的参考条件，进样 10 l，进行试样（7.2）的测定。注：若样品中磺胺类抗生素浓度过高，超出校准曲线范围，应稀释后测定，采用甲酸（5.3）水溶液进行稀释。8.3.2 空白试 验 按照与校准曲线的建立（8.1）相同的参考条件，进样 10 l，进行空白试样（7.3）的测定。9 结果计 算与 表示 9.1 定性分 析 按照表2中确定的母离子和子离子进行检测，在相同实验条件下，试样中磺胺类抗生素的保留时间与标准样品中磺胺类抗生素的保留时间相对偏差的绝对值应小于2.5%；且待测样品中定性离子的相对丰度（Ksam）与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子相对丰度（Kstd）进行比较，所得偏差在表3规定的最大允许偏差范围内，则可判定为样品中存在磺胺类抗生素。Ksam=12AA 100%.（1）式中：Ksam样品中磺胺类抗生素定性离子的相对丰度，%；A2样品中磺胺类抗生素定性离子的峰面积（或峰高）；DB21/T 3286 2020 6 A1样品中磺胺类抗生素定量离子的峰面积（或峰高）。Kstd=12stdstdAA 100%.（2）式中：Kstd标准样品中磺胺类抗生素定性离子的相对丰度，%；Astd2标准样品中磺胺类抗生素定性离子的峰面积（或峰高）；Astd1标准样品中磺胺类抗生素酸定量离子的峰面积（或峰高）。表3 定性 确证 时相 对离 子 丰度的 最大 允许 偏差 Kstd Ksam相对于Kstd的最大允许偏差 Kstd50 20%20Kstd50 25%10Kstd20 30%Kstd10 50%9.2 定量分 析 当磺胺类抗生素采用标准曲线法进行定量时，样品中磺胺类抗生素的质量浓度 x按公式（3）计算：DVVix1.（3）式中：x 样品中磺胺类抗生素的质量浓度，g/L；1计算磺胺类抗生素的峰面积（或峰高）与内标物的峰面积（或峰高）比值和内标物浓度的乘积后，由标准曲线（8.2.1）所得试样中磺胺类抗生素的质量浓度，g/L；Vi萃取液浓缩后的体积，ml；V 水样体积，ml；D 样品稀释倍数。9.3 结果 表示 当测定结果小于1 mg/L时，保留至小数点后三位；当测定结果大于或等于 1 mg/L时，保留三位有效数字。10 精密度 和准 确度 10.1 精密度 3家实验室分别对磺胺类抗生素的加标浓度为0.050 g/L和0.500 g/L的地表水、废水和海水进行了6次重复测定。DB21/T 3286 2020 7 地表水实验室内相对标准偏差分别在5.9%10%、4.3%12%之间，实验室间相对标准偏差分别在1.5%4.2%、0.6%1.6%之间，重复性限分别在0.009 g/L0.011 g/L、0.065 g/L0.078 g/L之间，再现性限分别在0.009 g/L0.012 g/L、0.065 g/L0.078 g/L之间。废水实验室内相对标准偏差分别在5.0%10%、3.4%8.4%之间，实验室间相对标准偏差分别在1.3%4.5%、0.7%2.9%之间，重复性限分别在0.009 g/L0.011 g/L、0.066 g/L0.077 g/L之间，再现性限分别在0.010 g/L0.011 g/L、0.066 g/L0.077 g/L之间。海水实验室内相对标准偏差分别在5.1%10%、4.3%7.4%之间，实验室间相对标准偏差分别在0.6%4.1%、0.3%1.3%之间，重复性限分别在0.008 g/L0.0010 g/L、0.070 g/L0.079 g/L之间，再现性限分别在0.008 g/L0.010 g/L、0.071 g/L0.079 g/L之间，具体见附录A中表A.1。10.2 准确度 3家实验室分别对磺胺类抗生素的加标浓度为0.050 g/L和0.500 g/L的地表水、废水和海水进行了6次重复测定，其中地表水加标回收率范围在80.2%87.3%、86.8%-90.7%之间；废水加标回收率范围在79.1%87.9%、84.1%-93.8%之间；海水加标回收率范围在81.8%87.9%、88.2%-92.1%之间，具体见附录A中表A.2。11 质量保 证和 质量 控制 11.1 空白试 验 每批样品（20个/批）至少做一个空白实验，空白试样值低于方法检出限。11.2 校准 校准曲线的相关系数r0.995，否则应重新绘制校准曲线；每批样品（20个）应测定一个曲线中间校核点，其测定结果与校准曲线相应点浓度的相对误差应在20%以内。11.3 精密度 控制 每批样品应至少测定10%的平行双样，样品数量少于10个时，应至少测定一个平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应在20%以内。11.4 准确度 控 制 每批样品应至少测定5%的基体加标样品，样品数量少于20个时，应至少测定一个基体加标样品，加标回收率应在75%110%之间。12 废物处 理 实验过程中产生的废液和废物应分类收集和保管，委托有资质的单位进行处理。DB21/T 3286 2020 8 附录 A（资料 性附 录）方法的 精密 度 和 准确 度 三家实验室分别对2种不同浓度的样品进行了测定。精密度和准确度结果见表A.1和表A.2。表A.1 方 法的 精密 度 样品类型 精密度统计结果 化合物名称 加标浓度（g/L）实验室内 相对标准偏差（%）实验室间 相对标准偏差（%）重复性限 r（g/L）再现性限R（g/L）地表水 磺胺嘧啶 0.050 6.510 3.6 0.009 0.009 0.500 4.65.7 0.7 0.065 0.065 磺胺甲基嘧啶 0.050 6.710 3.9 0.010 0.010 0.500 5.77.2 0.8 0.078 0.078 磺胺二甲嘧啶 0.050 7.812 4.2 0.011 0.012 0.500 5.26.3 1.3 0.073 0.073 磺胺对甲氧嘧啶 0.050 5.99.6 1.5 0.009 0.009 0.500 4.35.8 0.6 0.066 0.066 磺胺甲恶唑 0.050 6.29.8 4.0 0.009 0.010 0.500 5.56.7 1.6 0.074 0.074 废水 磺胺嘧啶 0.050 7.29.5 2.7 0.010 0.010 0.500 3.47.2 2.6 0.076 0.077 磺胺甲基嘧啶 0.050 5.19.6 1.3 0.010 0.010 0.500 3.58.4 2.9 0.077 0.079 磺胺二甲嘧啶 0.050 5.810 3.0 0.010 0.010 0.500 4.27.2 1.7 0.069 0.069 磺胺对甲氧嘧啶 0.050 5.78.4 4.5 0.009 0.010 0.500 5.06.7 0.7 0.077 0.077 磺胺甲恶唑 0.050 5.09.6 1.8 0.011 0.011 0.500 4.76.2 1.0 0.066 0.066 海水 磺胺嘧啶 0.050 5.19.1 3.7 0.009 0.009 0.500 4.36.8 0.3 0.073 0.073 磺胺甲基嘧啶 0.050 6.48.8 3.6 0.009 0.009 0.500 4.77.4 1.1 0.077 0.077 磺胺二甲嘧啶 0.050 5.29.2 4.1 0.008 0.008 0.500 4.76.4 0.6 0.071 0.071 磺胺对甲氧嘧啶 0.050 6.78.5 1.6 0.009 0.009 0.500 6.06.7 0.6 0.079 0.079 DB21/T 3286 2020 9 磺胺甲恶唑 0.050 6.010 4.1 0.010 0.010 0.500 4.96.6 1.3 0.070 0.070 表A.2 方 法的 准确 度 样品类型 准确度统计结果 化合物名称 实际样品浓度（g/L）加标浓度（g/L）回收率范围（%）加标回收率最终值（%）PS P 2 地表水 磺胺嘧啶 ND 0.050 80.285.6 83.76.0 ND 0.500 87.788.8 88.41.2 磺胺甲基嘧啶 ND 0.050 80.986.7 84.76.6 ND 0.500 86.888.2 87.71.6 磺胺二甲嘧啶 ND 0.050 80.187.2 83.57.2 ND 0.500 87.689.8 88.92.4 磺胺对甲氧嘧啶 ND 0.050 84.286.6 85.62.6 ND 0.500 88.589.6 88.91.2 磺胺甲恶唑 ND 0.050 81.087.3 84.86.6 ND 0.500 88.090.7 89.03.0 废水 磺胺嘧啶 ND 0.050 84.287.9 85.34.4 ND 0.500 89.193.8 91.14.8 磺胺甲基嘧啶 0.012 0.050 80.184.3 82.54.4 0.012 0.500 84.189.2 87.05.2 磺胺二甲嘧啶 ND 0.050 81.786.8 84.25.2 ND 0.500 86.088.8 87.62.8 磺胺对甲氧嘧啶 ND 0.050 80.687.5 84.97.6 ND 0.500 88.789.8 89.31.2 磺胺甲恶唑 0.012 0.050 79.183.7 82.05.0 0.012 0.500 86.387.4 87.32.0 海水 磺胺嘧啶 ND 0.050 82.484.7 84.43.8 ND 0.500 88.291.5 89.33.8 磺胺甲基嘧啶 ND 0.050 81.886.7 84.75.2 ND 0.500 88.590.9 89.32.8 磺胺二甲嘧啶 ND 0.050 83.386.8 85.23.6 ND 0.500 89.492.1 90.72.8 磺胺对甲氧嘧啶 ND 0.050 84.786.8 85.72.2 ND 0.500 88.889.7 89.41.0 磺胺甲恶唑 ND 0.050 83.287.9 85.64.8 ND 0.500 89.390.3 90.01.2 DB21/T 3286 2020 10