ICS 01.040.85 Y32 DB43 湖南省地方标准 DB43/T 1657 2019 洞庭湖荻 苇中不可 溶性糖含 量的测定 液相色谱法 Determination of insoluble saccharides of reeds in Dongting Lake Liquid chromatography 2019-09-16 发布 2019-12-16 实施 湖 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB43/T 1657 2019 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语及 定义.1 4 原理.1 5 仪 器和 试剂.1 6 样 品准 备.2 7 高 效液 相色 谱仪 操作 条 件.2 8 试 验步 骤.3 9 结 果报 告.4 10 试 验报 告.4 DB43/T 1657 2019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。本标准起草单位：常德市产商品质量监督检验所/国家生活用纸质量监督检验中心。本标准主要起草人：彭小悦、郭盛、孙华、罗云鹰、张乐华、代泳波。本标准由湖南省生活用纸标准化技术委员会归口。本标准为首次发布。DB43/T 1657 2019 1 洞庭湖荻 苇中不 可溶性糖 含量的 测定 液相色 谱法 1 范围 本标准 规定 了测 定洞 庭湖 荻苇原 料中 不可 溶性 糖含 量的测 定方 法和 规范。本标准 适用 于不 含抽 提物 的荻苇 原料。对 于未 经处 理的含 有抽 提物 的荻 苇原 料样品，必 须事 先去 除样品中 的抽 提物 才能 进行 分析。本 标 准 同样 适用 于 酸或碱 处理 后（洗 涤至 不 含残余 酸或 碱）以 及发 酵 剩余物质 中固 体样 品的 不可 溶性糖 含量 测定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 2677.1 造纸 原料 用分析 试样 的采 取 GB/T 2677.2 造纸 原料 水分的 测定 GB/T 2677.5 造纸 原料 有机溶 剂抽 出物 含量 的测 定 3 术语及 定义 3.1 新鲜荻 苇原 料 当年现 场取 用的 荻苇 原料。3.2 绝干质 量 不含水 的生 物质 原料 质量，按照GB/T 2677.2 标准 方 法所述 步骤 在105 烘干 获 得。3.3 准备好 的生 物质 样品 根据GB/T 2677.1 标 准方 法 处理得 到的 固体 含量 大于85%的生 物质 样品。3.4 不含抽 提物 的 生 物质 样品 根据GB/T 2677.5 标准 方法 处理得 到的不 含有 抽提 物 的样品，该 方法可 去除 荻 苇原料 中包 括可溶 性糖在内 的各 种可 溶性 组分。4 原理 荻苇原 料中 的不 可溶 性糖，通过 两段 硫酸 水解 后可 转化为 其相 对应 的单 糖。采用高 效液 相色 谱检 测水解液 中的 单糖 含量 后，通过计 算可 得到 生物 质原 料中的 不可 溶性 糖。5 仪器和 试剂 DB43/T 1657 2019 2 5.1 仪器和 材料 5.1.1 分析天 平：读数 精 度 0.1mg；5.1.2 高压反 应器：控 温要 求 121 3；5.1.3 水浴锅：控 温要 求 30 1；5.1.4 鼓风干 燥箱：控 温要 求 45 3、105 3；5.1.5 干燥器：装 有无 水硫 酸钙 或其它 干燥 剂；5.1.6 高效液 相色 谱：配备 示差 折光检 测器；5.1.7 进样瓶；5.1.8 一次性 注射 器（1mL 和3mL）；5.1.9 一次性 水相 滤头（0.22 m）；5.1.10 玻璃血 清瓶(125mL)具备耐 腐蚀 性的 橡胶 密封 塞（如 有聚 四氟 乙烯 覆膜 层）和 铝制 密封 圈。也可 用其它 具有 耐高 温、耐高压、耐腐 蚀性 的可 严密 密封的 容器 取代。5.1.11 称量纸；5.1.12 玻璃试 管（16100mm）；5.1.13 锥形瓶（容 积 50mL）；5.1.14 pH 试 纸。5.2 试剂 除非特 别说 明，本标 准所 用 试剂均 为分 析纯 试剂。所 用 水的纯 度必 须满 足 实 验室 用水二 级水 的标 准。5.2.1 碳酸钙 5.2.2 高纯度 标准 品（98%）：葡萄糖、木 糖、半乳 糖、阿拉伯 糖、甘露 糖，均 在 45 3 下烘 干至 恒重。5.2.3 浓硫酸 5.2.4 稀硫酸（72%w/w 或12.00 0.02mol/L）：在冰浴 及充 分搅 拌的 条件 下，缓缓 将665mL 的 浓硫 酸（5.2.4）加 入至300mL 水中；将 溶液 温度 调 整至20，并 将其 相对 密度 调整至1.6338。6 样品准 备 按照GB/T 2677.1 标准 方法，将新 鲜的生 物质 原料 样 品进行 干燥、粉碎、筛 分，得到 准备 好的生 物质原料 样品；然后，依 照GB/T 2677.5所 述标准 步骤 对准备 好的 生物质 原料 样 品进行 抽提，去除 其含 有的抽提 物，经干 燥后 得到 不含抽 提物 的生 物质 原料 样品。7 高效液 相色 谱仪 操作 条件 DB43/T 1657 2019 3 以HP Model 1090 型 高效 液 相色谱 仪（含示 差折 光检 测器）、BioRad Aminex HPX-87C 或HPX-87P 型色谱 柱（配 备合 适的 保护 柱）为 例，其操 作条 件为：进 样 体积50L，淋洗 液为去 离 子水（氦 气或 真空 脱气、电阻18M 欧姆、0.2 m 滤膜过 滤），柱流 量0.6mL/min，柱 温85，数据 采集20分钟、后运 行15 分钟。8 试验步 骤 8.1 标准曲 线 8.1.1 标准溶 液配 制 分别准 确称 取4.0g 的 葡萄 糖、木 糖、阿 拉伯 糖、半 乳糖、甘露 糖，溶 解至1L 的超纯 水中，配 制成 浓度为4.0g/L 的混 合糖 标准 溶 液，并 用一 次性0.22 m 水 相滤头 将其 过滤。将 该标 准溶液 按照 相应 比例 进行稀释，分别 得到7个 水平（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0g/L）的 混合 糖标 准溶液。8.1.2 高效液 相色 谱检 测 对于具 有自 动进 样器 的高 效液相 色谱 仪，用 移液 枪 移取约1.5mL 的 上述 七个 水 平的混 合糖 标准 溶液、并分装 至进 样瓶 中，进 行糖 含量检 测。对 于需 要手 动进 样的高 效液 相色 谱仪，用一 次性注 射器 移取 约1mL的混合 糖标 准溶 液，打 入 手动进 样阀 的阀 口、进 行 糖含量 检测。记录 不同 浓 度下各 种糖 的液 相色 谱信 号值。8.1.3 建立标 准工 作曲 线 分别以 五种 糖的 浓度 为横 坐标、液相 色谱 信号 值为 纵坐标 做图，并 利用 线性 回归工 具拟 合图 中数 据点，得 到各 种糖 的标准 工作 曲线，即：n n n nb A k c+=（1）式中：n 糖种 类标 识；c n 某糖 在溶 液中 的浓 度（g/L）；A n 某 糖的 液相 色谱 信 号值；k n 某糖 标准 工作 曲线 的斜率（g/L）；b n 某糖 标准 工作 曲线 的截距（g/L）。8.2 荻苇样 品处 理及 检测 8.2.1 72%硫 酸预 水解 准 确称 取300 10mg 不含 抽提物 的粉 状生 物质 原料、重量 精确 至0.1mg。将称 量好的 不含 抽提 物 的粉状生 物质 原料 转移 至玻 璃试管 中，准确 加入3.00 0.01mL（4.92 0.01g）72%硫酸，并用 搅动 至固 液完全混 合。将该 试管 放入30 1 的 水浴 锅 中，水 解 时间为1小 时；为了 确保 样 品完全 混合、润 湿，每隔15分钟 搅动 一次。8.2.2 水解产 物稀 释 将按照8.2.1 处理 后的 全部 水解产 物转 移至 玻璃 血清 瓶中，使 用84.00 0.04 mL 的水将 其稀 释至 硫酸浓度4%w/w。在转 移、稀释 过 程中，可 采用 多次 洗涤 的 方式 将所 有水 解后 固体 及 水解 液 转移 至 玻璃 血清 瓶，由此获 得的 水解产物 稀释 液、其 总重 应为89.22g 或总体 积87mL。将 装有 稀释 好的水 解产 物的玻璃血清 瓶用 橡胶 塞和 铝盖 密封。DB43/T 1657 2019 4 8.2.3 高温水 解 将8.2.2 所 述密 封好 的 玻 璃 血清瓶 放入 高压 反应 器内，在121 3 下水 解1 小时。水 解完 成后，将 玻璃血清 瓶取 出、在室 温下 冷却20 分钟。8.2.4 水解液 中和 与过 滤 将玻璃 血清 瓶的 密封 铝盖 及橡胶 塞打 开，移 取20mL 的水解 液至50mL 的锥 形瓶 中；将碳 酸钙 缓缓 加至瓶中，用pH 试 纸检 测水 解液pH 值、直至 溶液pH 值在56 之 间为 止，切 不可 过 度中和 至pH 值高 于6。为了避免 产生 泡沫 及由 于液 体过热 产生 水蒸 气而 导致 的水损 失，碳 酸钙 加入 速 度一定 要缓 慢。用3mL的一次 性注 射器 吸 取 上清 液，然 后配 合一 次性0.22 m 水相 滤头 将其 过滤 至进 样瓶中。如 糖浓 度过 高，可 将滤液按 需求 进行 稀释（稀 释比例 记为D），再加入 至 进样瓶 中。8.2.5 水解液 糖含 量测 定 按照8.1.2 检 测水 解液 或其 稀释液 中的 糖含 量，记录 各种糖 的检 测信 号A n,0。9 结果报 告 9.1 荻苇样 品中 糖含 量的 计算 以 绝干 原料 计，荻苇 样品中 的糖 含量 可用 下式 计算%1000.87)(10,10,+=nn n nnR mb A k Dwc（3）式中：n 糖种 类标 识；c n,0 荻 苇原 料中 某糖 的含量（%）；D 水解 液检 测前 的 稀释倍 数（8.2.4）；A n,0 荻苇 原料 水解 后 的待测 液中 某糖 的液 相色 谱信号 值；87.0 酸水 解过 程中 液体在 室温 下的 总体 积（mL）；m 1 用于 检测 的不 含 抽提物 的荻 苇原 料绝 干质 量（g）；w 1 不含 抽提 物的 荻 苇原料 占绝 干荻 苇原 料的 比例（%）。9.2 结果的 表示 单位绝 干质 量的 荻苇 原料 中各种 糖（以单 糖计）所 占的质 量百 分比，结 果保 留两位 有效 数字，三 次测定的 相对 标准 偏差 应小 于5%。10 试验报 告 试验报 告应 包括 以下 内容：本标准 编号；所用仪 器类 型；仪器操 作条 件；试验结 果；测试中 观察 到的 任何 异常 情况；任何与 本标 准的 偏差；DB43/T 1657 2019 5 本标准 或引 用的 规范 性文 件中未 规定 的并 可能 影响 结果的 任何 条件。_