ICS 07.100.99 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1849 2020 动物垫料 中大肠菌 群检测 Detection for coliforms in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB 15/T 1849 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由中 华人 民共 和国 呼和浩 特海 关提 出并 归口。本标准 起草 单位：中华 人 民共和 国呼 和浩 特海 关、鄂尔多 斯市 动物 疫病 预防 控制中 心、内 蒙古 自治区农牧 业科 学院。本标准 主要起 草人：赵治 国、延 涵、崔 强、王海艳、于志 超、陈 林军、敖威 华、张 晓东、盛万 里、罗晓平、李 军燕。DB 15/T 1849 2020 1 动 物垫料 中大肠菌 群检测 1 范围 本标准 规定 了动 物垫 料中 大肠菌 群MPN 计 数法 和平 板 计数法。本标准 适用 于动 物垫 料中 大肠菌 群的 定量 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB/T 8170 数 值修 约规 则 与极限 数值 的表 示和 判定 SN/T 1538.1 培养 基制 备 指南 第 1 部 分：实验 室培 养基制 备质 量保 证通 则 SN/T 1538.2 培养 基制 备 指南 第 2 部 分：培养 基性 能测试 实用 指南 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 动物垫 料 animal bedding 用于吸 收动 物排 泄物，使 动物保 持舒 适生 活环 境的 铺垫物。也 包括 动物 笼内 非直接 与动 物机 体接 触的铺垫 物。3.2 大肠菌 群 coliforms 培养条 件下 能发 酵乳 糖、产酸产 气的 需氧 和兼 性厌 氧的一 群革 兰氏 阴性 无芽 胞杆菌。3.3 最可能 数 most probable number(MPN)泊松分 布的 一种 间接 计数 方法。3.4 菌落形 成单 位 colony forming unit（CFU）在琼脂 平板 上经 过一 定温 度和时 间培 养后 形成 的每 一个菌 落，是计 算细 菌或 霉菌数 目的 单位。DB15/T 1849 2020 2 4 检验原 理 4.1 MPN 计 数法 MPN计数 法是 统计学 和微 生 物学相 结合的 一种 定量检 测法。待测样 品经 系列稀 释并培 养后，根据 其未生长 的最 低稀 释度 与生 长的最 高稀 释度，应 用统 计 学概率 论推 算出 待测 样品 中大肠 菌群 的最 大可 能 数。4.2 平板计 数法 大肠菌 群在 固体 培养 基中 发酵乳 糖产 酸，在指 示剂 的 作用 下形 成可 计数 的红 色或紫 色，带有 或不 带有沉淀 环的 菌落。5 仪器和 设备 5.1 恒温培 养箱：36 1。5.2 冰箱：2 5。5.3 恒温水 浴箱：46 1。5.4 天平：感 量0.1 g，0.0001 g。5.5 均质器。5.6 漩涡 混 合器。5.7 高压灭 菌器。5.8 菌落计 数器。5.9 无菌试 管：18 mm 180 mm。5.10 无菌吸 管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或 微量 移液 器及 吸 头。5.11 无菌滤 膜均 质袋。5.12 无菌锥 形瓶：500 mL。5.13 无菌量 筒。5.14 无菌规 格板：5 cm 5 cm。5.15 无菌培 养皿：15 mm 90 mm。5.16 无菌棉 签。5.17 无菌镊 子。5.18 无菌剪 刀。5.19 无菌勺。5.20 pH 计或 pH 比色 管或 精密pH 试纸。6 培养基 和试 剂 6.1 实验用 水：符 合GB/T 6682 的要 求。6.2 月桂基 硫酸 盐胰 蛋白 胨(lauryl sulfate tryptose，LST)肉 汤：见附 录A.2。6.3 煌绿乳 糖胆 盐(brilliant green lactose bile，BGLB)肉汤：见 附 录A.3。6.4 结晶紫 中性 红胆 盐琼 脂(violet red bile agar，VRBA)：见 附 录A.4。6.5 无菌磷 酸盐 缓冲 液：见附 录 A.5。6.6 无菌生 理盐 水：见附 录 A.6。6.7 NaOH 溶液（1 mol/L）：见附 录 A.7。DB 15/T 1849 2020 3 6.8 HCL 溶 液（1 mol/L）：见 附录 A.8。7 MPN 计 数法 7.1 采样 7.1.1 采样原 则 样品采 集应 遵循 随机 性、代表性 的原 则。采样 过程 遵循无 菌操 作程 序，防止 一切可 能的 外来 污 染。7.1.2 颗粒状 或粉 末样 品 对送检 样品包 装内 不同部 位样品 进行随 机多 点取样 至少250 g，充分混 匀后 称 取25 g 颗粒状 或粉 末状垫料 样品，加 入225 mL 无菌稀 释液（磷 酸盐 缓冲 液或生 理盐 水），充 分振 摇或均 质1 min 2 min，制成1:10 的样 品匀 液。7.1.3 平面样 品 无菌操 作将 灭菌 规格 板（5 cm 5 cm）放在 平面 垫 料 表面，用浸 有无 菌稀 释液（磷酸 缓冲 液或 生理盐水）的棉拭 子，在规格 板内来 回均匀 涂抹 整个方 格3 次，并随 之转动 棉拭 子，然后 用灭菌 剪刀 剪去棉拭子与 手接触 的部 分，将 棉拭子 头置入 装有25 mL 无 菌稀释 液的无 菌锥 形瓶中，根据 样品面 积大 小重复采样1 4个 规格 板面 积，采样量 见表1，相应 地将 棉 拭子头 置入25 mL 100 mL 的无菌 稀释 液中，充 分振摇制成样品 原液（1 mL 原液对应的样 品面积为1 cm2）。取1 mL 样品原液注入含有9 mL 无 菌稀释液的试管中，制成1:10 的样 品匀 液。表1 不同面 积平 面类 垫料 样品 采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于0.25（含）25 1 0.25 0.5（含）50 2 0.5 0.75（含）75 3 大于0.75 100 4 7.2 稀释 7.2.1 样品匀 液 的pH 应在6.5 7.5 之 间，必要 时用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCL 调节。7.2.2 用1 mL 无 菌吸 管或 微量 移 液器吸 取 1:10 样品 匀液1 mL，沿管 壁缓 缓注 入 9 mL 磷酸 盐缓 冲液或生理 盐水 的无 菌试 管中（注意 吸管 或吸 头尖 端不 要触及 稀释 液面），振摇 试管或 换 用 1 支 1 mL 无菌吸管或 吸头 反复 吹打，使 其混合 均匀，制 成1:100 的样品 匀液。7.2.3 根据对 样品 污染 状况 的估 计，按上 述操 作，依次 制 成 10 倍递 增系 列稀 释的 样 品匀液。每递 增稀释 1 次，换 用1 支1 mL 无 菌吸管 或吸 头。从制 备样 品 匀 液至 样品 接种 完毕，全 过 程不 得超过 15 min。DB15/T 1849 2020 4 7.3 初发酵 试验 每个样 品选 择3 个适 宜的 连续稀 释度 的样 品匀 液(液 体样品 可以 选择 原液)，每 个稀释 度接 种 3 管月桂基硫 酸盐 胰蛋 白胨（LST）肉汤，每 管接 种 1 mL（如接种 量超 过 1 mL，则 用 双料LST 肉 汤），36 1 培养 24 h 2 h，观 察导管 内是 否有 气泡 产生，24 h 2 h 产气 者进 行复 发酵试 验（证实 试验），如未产 气则 继 续 培养 至48 h 2 h，产气 者进 行复 发 酵试验。未 产气 者为 大肠 菌群阴 性。7.4 复发酵 试验(证 实试 验)用接种 环从 产气 的LST 肉 汤管中 分别 取培 养 物 1 环，移种 于煌 绿乳 糖胆 盐肉 汤（BGLB）管中，36 1 培养 48 h 2 h，观察产 气情 况。产气 者计 为大肠 菌群 阳性 管。7.5 大肠菌 群最 可能 数(MPN)的 报告 按7.4 确证 的大 肠菌 群BGLB 阳 性管 数，检索MPN 表（见附 录 B），报告 每g（cm2）样品 中大 肠菌群的 MPN 值。8 平板计 数法 8.1 采样 按7.1 进行。8.2 稀释 按7.2 进行。8.3 平板计 数 8.3.1 选取2 3 个适 宜的 连续 稀 释度，每个 稀释 度接 种 2 个无菌 平皿，每 皿1 mL。同时 取 1 mL 磷酸盐缓冲 液或 生理 盐水 加入 无菌平 皿作 空白 对照。8.3.2 及时将 约15 mL 20 mL 融 化并恒 温 至45 50 的结晶 紫中 性红 胆盐 琼脂（VRBA)倾 注于 每个平皿 中。小心 旋转 平皿，使培 养基 与样 液充 分混 匀，待 琼脂 凝固 后，加 3 mL 4 mL VRBA 琼脂 覆盖 平板表层。凝 固后 翻转 平板，于 36 1 培 养18 h 24 h。8.4 平板菌 落数 的选 择 选取菌 落数在15 CFU 150 CFU 之 间的平 板，分 别计 数平板 上出现 的典型 和可 疑大肠 菌群菌 落。典型 菌落 为紫 红色，菌 落 周 围有红 色的 胆盐 沉淀 环，菌落直 径为0.5 mm 或 更大。8.5 证实试 验 从每个VRBA 平板 上分 别挑 取10个 不同 类型 的典 型和 可疑菌 落，少于10 个 菌落 的 挑取全 部典 型和 可疑菌落。分别移 种于BGLB 肉 汤管内，36 1 培 养24 h48 h，观察 产气情 况。BGLB 肉汤 管产 气，可报告为 大肠 菌群 阳性。8.6 大肠菌 群平 板计 数结 果计 算与报 告 DB 15/T 1849 2020 5 8.6.1 大肠菌 群平 板计 数结 果的 计算 8.6.1.1 若只有 一个 稀释 度平 板上 的菌落 数在 适宜 计数 范围 内，分 别计 算经 最后 证实 为大肠 菌群 阳性的试管 比例 乘 以8.4 中计 数的平 板菌 落数，计 算平 均值，再将 平均 值乘 以相 应稀释 倍数，即 为每g(cm2)样品中 大肠 菌群 数。例：加 入 10-2样 品稀 释液 的2 个VRBA 平 板上 分别 有 82 个和64 个 典型 或可 疑菌 落，从每个 平皿 分别 挑取 其 中10 个 菌落 接种BGLB 肉汤 管，分 别证 实有7 个和 8 个阳性 管，则该 样品 的大 肠菌群数 为：（82 7/10+64 8/10）1022=5.4 103 CFU/g(cm2)。8.6.1.2 若有2 个连 续稀 释度 的平 板菌落 数在 适 宜 计数 范围 内时，先计 算适 宜计 数范 围内每 个平 皿经最后证 实为 大肠 菌群 阳性 的菌落 数，再按 公式（1）计算样 品中 大肠 菌群 平板 计数结 果：d n nCN)1.0(2 1（1）式中：N 样 品中 大肠 菌群 板计 数结果；C 平板（含 适宜 范围 菌落数 的平 板）证实 为大 肠菌群 阳性 的菌 落数 之和；n1 第一 稀释 度（低稀 释 倍数）平板 个数；n2 第二 稀释 度（高稀 释 倍数）平板 个数；d 稀释 因子（第 一稀 释 度）。8.6.1.3 若所有 平板 上菌 落数 均大 于 150 CFU，则 对稀 释度 最高的 平皿 菌落 进行 确认，根据 菌落 确认结果，利 用8.6.1.1 中方 法，计 算样 品中 大肠 菌群 平板计 数结 果。8.6.1.4 若所有 平板 上菌 落数 均小 于 15 CFU，则应 按稀 释度 最低的 平皿 菌落 进行 确认，根据 菌落 确 认结果，利 用8.6.1.1 中方 法，计 算样 品中 大肠 菌群 平板计 数结 果。8.6.1.5 若所有 稀释 度的 平板 菌落 数均不 在 15 CFU 150 CFU 之间，其 中一 部分 小于15 CFU 或大 于150 CFU 时，则 以最 接近15 CFU 或150 CFU，且稀 释 倍数较 少的 平皿 菌落 数进 行确认，利 用 8.6.1.1中方法，计 算样 品中 大肠 菌群平 板计 数结 果。8.6.1.6 若所有 稀释 度（包括 液体 样 品原液）平 板均 无菌 落生 长，则以 小于1 乘 以最 低稀 释 倍数计 算。8.6.2 报告 8.6.2.1 大肠菌 群平 板计 数结 果按“四 舍五 入”原 则修 约。结果 在 10 CFU 以内 时，采 用一位 有效 数字报告；结果 在10 CFU 100 CFU 之间 时，采用 两位 有效数 字报 告。8.6.2.2 大肠菌 群平 板计 数结 果大 于或等 于 100 CFU 时，第 3 位数 字采 用“四舍 五入”原则 修约 后，取前2 位数 字，后面 用0 代替位 数来 表示 结果；也 可用 10 的 指数 形式 来表 示，此时 按照“四 舍五 入”原则修 约，采用 两位 有效 数字。具体 修约 规则 按 照GB/T 8170 执行。8.6.2.3 若空白 对照 平板 上有 大肠 菌群菌 落出 现，则此 次检 验结果 无效。8.6.2.4 以CFU/g 或CFU/cm2为 单位 报告大 肠菌 群平 板计 数结 果。DB15/T 1849 2020 6 A A 附 录 A（规范 性附 录）培养基 和试 剂 A.1 培养基 制备 及质 量保 证 按照SN/T 1538.1 和SN/T 1538.2 执 行，并对 制备 好的 培养基 进行 性能 测试，如 使用等 效的 脱水 合成培养基，使 用前 对其 进行 验收并 按其 说明 书使 用。A.2 月桂基 硫酸 盐胰 蛋白 胨(LST)肉汤 A.2.1 成分 胰蛋白 胨或 胰酪 胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢 二钾(K2HPO4)2.75 g 磷酸二 氢钾(KH2PO4)2.75 g 月桂基 硫酸 钠 0.1 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 将上述 成分 溶解 于蒸 馏水 中，调节pH 至6.8 0.2，分 装到有 倒立 发酵 管的 试管 中，每管10 mL，121 高压灭 菌15 min 备用。A.3 煌绿乳 糖胆 盐(BGLB)肉汤 A.3.1 成分 蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆盐 20.0 g 0.1%煌 绿水 溶液 0.0133 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 准确称 取以 上成 分，加1000 mL 蒸 馏水，加 热煮 沸至 完全溶 解，调节pH至7.2 0.2，分装 于有 倒立发酵管 的试 管中，每 管10 mL，121 高压 菌15 min 备用。A.4 结晶紫 中性 红胆 盐琼 脂(VRBA)DB 15/T 1849 2020 7 A.4.1 成分 蛋白胨 7.0 g 胆盐 1.5 g 酵母粉 3.0 g 乳糖 10.0 g 氯化钠 5.0 g 中性红 0.03 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL A.4.2 制法 准确称 取以 上成 分，加1000 mL 蒸 馏水，静 置几 分钟，充 分搅拌 溶解，调节pH 至7.4 0.1。煮 沸2 min，将培养 基融 化并 恒温 至45 50 倾注 平板。使 用 前3 h 内制 备。A.5 磷酸盐 缓冲 液 A.5.1 成分 磷酸二 氢钾(KH2PO4)34.0 g 蒸馏水 500 mL A.5.2 制法 贮存液：称 取34.0 g 的磷 酸二氢 钾溶 于500 mL 蒸馏 水中，用大 约175 mL 的1 mol/L氢 氧化 钠溶 液调节pH至7.2 0.2，用 蒸馏 水稀释 至1000 mL 后 贮存 于4 冰 箱。稀释液：取 贮存 液1.25 mL，用蒸 馏水 稀释 至1000 mL 分装于 适宜 容器 中，121 高压 灭菌15 min备用。A.6 无菌生 理盐 水 A.6.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.6.2 制法 称取8.5 g 氯化 钠溶 于1000 mL 蒸 馏水 中，121 高 压 灭菌15 min 备用。A.7 1 mol/L NaOH溶液 A.7.1 成分 氢氧化 钠 40.0 g 蒸馏水 1000 mL DB15/T 1849 2020 8 A.7.2 制法 称取40 g 氢 氧化 钠溶 于1000 mL 无 菌蒸 馏水 中。A.8 1 mol/L HCL 溶液 A.8.1 成分 HCL 90 mL 蒸馏水 1000 mL A.8.2 制法 量取浓 盐酸90 mL，用无 菌 蒸馏水 稀释 至1000 mL。DB 15/T 1849 2020 9 B B 附 录 B（规范 性附 录）大肠菌 群最 可能 数(MPN)检 索表 每g(cm2)检 样中 大肠 菌群 最可能 数(MPN)的检 索见 表B.1。表B.1 大肠菌 群最 可能 数(MPN)检 索表 阳性管数 MPN 95%可信限 阳性管数 MPN 95%可信限 0.1 0.01 0.001 上限 下限 0.1 0.01 0.001 上限 下限 0 0 0 1100 420 注1：本表采用3 个稀释度0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和0.001 g(mL)，每个稀释度接种3 管。注2：表内所列检样量如改用1 g(mL)、0.1 g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字要相应降低10 倍；如 改用0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字要相应提高10倍，其余类推。_