ICS 65.0 20.20 B 62 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T 18682018 兜兰菌根化育苗技术规程 Technical regulation for seedling cultivation of Paphioedilum with mycorrhizal fungi 2018-10-20 发布 2018-11-20 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发布 DB 45/T 1 86 8 20 18 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引 用文件.1 3 术语和定 义.1 4 组培苗移 栽.1 5 菌剂制备和处理.2 6 栽培管理.3 附录 A（资料 性附录）培养基配方.5 DB 45/T 1 86 8 20 18 III 前 言 本标准按照G B/T 1.12 0 09给出的规 则起草。本标准由广西壮族自治区农业科学院提出。本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院花卉研究所。本标准主要起草人：王晓国、闫海霞、周主贵、李秀玲、卢家仕、周锦业、何荆洲。DB 45/T 1 86 8 20 18 1 兜兰菌根化育苗技术规程 1 范围 本标准规定了兜兰菌根化育苗技术的术语和定义、组培苗移栽、菌剂制备和处理、栽培管理。本标准适用于兜兰菌根化育苗技术。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8 32 1(所有部分)农药合理使用准则 DB 45/T 1 31 6 同色兜兰 无菌播种繁育技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 菌根 m ycorr hi za 土壤中的某些真菌与高等植物营养根形成的一种互利共生体。3.2 菌根真菌 my co rr hi za l f un gi 能与植物根系形成菌根共生体的真菌。3.3 菌根菌剂 my co rr hi za l i no cu la nt 以菌根真菌为生产菌种制成的微生物接种菌剂。4 组培苗移栽 4.1 植株选择 选择根长2 c m 以上，主根数目2条以上，叶片数4 5片，叶长5.0 c m以上的组 培苗。4.2 炼苗 将组培苗带瓶移至炼苗室内，不开盖炼苗10 d 15 d，再移至 大棚开盖炼苗2 d。DB 45/T 1 86 8 20 18 2 4.3 基质 栽培基质采用兰石和松树皮按体积比1:3混合，或者珍珠岩、蛭石和松树皮按体积比1:2:4混合，加 入水使基质湿润后倒在白瓷盘中12 1 灭菌30 m in。4.4 容器 塑料穴盘54 c m2 8 c m，每 盘50穴；或 口径5 c m黑色 塑料杯。4.5 移栽 取出组培小苗，清水 洗去 培养基，用0.1 高 锰 酸钾溶液浸泡 5 mi n，在 荫 棚下 晾 15 m in。每穴（杯）种植1 株，将 组培苗种植在基质中，轻压 根部，淋透 定根水。5 菌剂制备和处理 5.1 菌剂制备 5.1.1 菌根检测 在兜兰 原 产 地 选取 野 生植 株 的营养根，截 取4 cm 5 c m的根 段。横向徒手切 片，厚度 0.2 mm 0.3 mm。切 片 放 入 盛 有无菌水的培养 皿 中，使其分 散，挑 取 较薄切 片，在 显 微 镜 下 观察 根 段 皮 层细胞 组 织 内是 否 形成有菌 丝团，目 镜 10 X，物 镜 10 X。5.1.2 菌根消毒处理 选取 具 有菌 丝团 的根 段，剥去毛被，在 流 水下 冲洗干净。在 超净工作台 内，用 7 5 酒精浸泡 4 mi n,无菌水 冲洗 1 2 次,再 用10 N aC lO 水 溶液浸泡 2 min,无菌水 冲洗 7 8 次。5.1.3 菌种分离与纯化 5.1.3.1 在 超净工作台 内，将 消毒 后的根 段切 成1 m m2 mm 的小 段,平铺 于 F I M固 体培养基上,24 恒 温 培养 3 d 5 d。5.1.3.2 待观察到 皮 层细胞 内长出的菌 丝 长入培养基 时，挑 取菌 丝尖端 接种 到 1/5 P DA 固 体培 养基。5.1.3.3 3 d后 观察，如果 菌 落 形 态仍 不 平滑且 有 杂 菌 时，再 次挑 取菌 落边缘尖端 菌 丝 接种 到 1/5 P DA 固 体培养基上，继续观察 接种；，重复 至菌 落 形成一 个圆滑 的形 状且 无 杂 菌 时，挑 取菌 落边缘尖端 菌 丝 接种 到F I M固 体培养基上 保存。5.1.3.4 培养基用 直 径9 cm 培 养 皿装盛，培养基配方 参见 附录 A。5.1.4 菌种选择 在 超净工作台 内，将分 离到 的菌种，接种 到 1/5 P DA 固 体培养 基上，待 菌 落 长 到直 径为 4 c m5 cm时，挑 取菌 丝置 于 载玻 片上，滴 23 滴 无菌水使菌 丝散 开，在 显 微 镜 下 观察 菌 丝 形 态，目 镜 10 X，物 镜 20 X。选 取 菌 丝 有 隔，呈直角 或 近直角 分 支，近 分 支 处有 隔；有 念 珠 状细胞呈椭圆 形或 短圆柱状 的菌 种 作 为菌根化菌剂（附 图 1）。5.1.5 菌种活化 在 超净工作台 内，挑 取0.2 cm 0.5 c m的菌种接种 在1/5 P DA培 养基上 活 化2 d，待 长出 完整 菌 落 后 进 行扩 大培养。DB 45/T 1 86 8 20 18 3 5.1.6 扩大培养 在超净工作 台内，在经过 活 化的菌 种中挑取菌 落边缘0.2 cm 0.5 cm的菌 丝，接种在1/5 PDA培养 基 上培养15 d。培养基用1 000 m L三角瓶装盛，培养基用量为40 0 m L。培养温度25，摇床转 速75 rp m/m。5.1.7 菌剂检验 吸取培养好的菌液1 mL于石 英比色皿内，600 nm的 波长下测量吸光值，吸光值范围1.0 1.5。吸 取 菌液滴13 滴在载玻片上，显微镜下观察菌液应无杂菌，目镜10 X，物 镜20 X。5.1.8 菌剂贮存 3 5 无 污染的环境贮存。5.2 菌剂处理 5.2.1 基质混合法 在育苗前，将菌根制剂施入经过灭菌处理的育苗基质，充分混合，室温放置2 d3 d，后再进行植 株接种。1份 菌根制剂与5 10份育苗 基质混合。5.2.2 灌根法 将菌根制剂与清水按体积比1:3比例 配制成菌剂悬浊液，然后将植株根部在菌剂悬浊液中浸泡1 h 3 h再种植。3 d后每植株在根 部 灌施5 m L 菌剂悬浊液，每隔10 d灌施 1次，共灌施 34次。6 栽培管理 6.1 接种后管理 6.1.1 光照 4 50 0 lx5 50 0 lx。6.1.2 温度 20 2 8，最高温度不应超过30。6.1.3 湿度 相对湿度65 80，保持共生基质湿润。6.1.4 施肥 复合肥（9-45-15）2 00 0 3 00 0 倍液喷洒叶面，3 次/月。6.2 菌根化种苗管护技术 6.2.1 光照 11 00 0 lx 1 3 00 0 lx。DB 45/T 1 86 8 20 18 4 6.2.2 温度 20 28，最高 温度 不应 超过 30。6.2.3 湿度 每 天喷洒 清水1 次，保持 湿 度 在65 80。6.2.4 施肥 60 复 合 肥（20-20-20）2 0 00 3 00 0 倍液喷洒 叶 面，2 次/周。6.3 病虫害防治 按照DB 45/T 13 16的方 法执 行，农药使用 参 照GB/T 83 21（所 有部分）的规定。DB 45/T 1 86 8 20 18 5 A A B 附 录 A（资料性附录）培养基配方 A.1 F IM培养基 Na NO 3 0.3 g，KH 2 PO 4 0.2 g，Mg SO 4 0.1 g，酵母浸出液0.1 g，蔗糖 2.5 g，琼脂 12 g，蒸馏 水1 00 0 m L，pH 6.8。A.2 1/5 PD A培养基 马铃薯40 g，葡萄糖4 g，琼脂15 g，蒸馏 水1 00 0 mL。菌根真菌菌丝形态见图A.1。图A.1 菌根真菌菌丝形态 C _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 中华人民共和国广西地方标准 兜兰菌根化育苗技术规程 DB45/T 1868 2018 广西壮族自治区质量技术监督局统一印刷 版权专有 侵权必究