ICS 07.100.99 B 41 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1850 2020 动物垫料 中菌落总 数检测 Detection for aerobic plate count in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1850 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出 的规 则起 草。本标准 由中 华人 民共 和国 呼和浩 特海 关提 出并 归口。本标准 起草 单位：中 华人 民共和 国呼 和 浩 特海 关、鄂尔多 斯市 动物 疫病 预防 控制中 心。本标准 主要 起草 人：赵治 国、陈 林军、敖 威华、延 涵、崔 强、王海 艳、于志 超、刘 佳、任彩 霞、刘来俊、张晓 东、杨帆、陈 少博。DB15/T 1850 2020 1 动 物垫料 中菌落总 数检测 1 范围 本标准规 定了动 物垫料 中菌 落总数的 平板计 数法。本标准适 用于动 物垫料 中菌 落总数的 定量检 测。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的 应用 是必不可少的。凡是注 日期 的引用文件，仅所注日 期的 版本适用于本文件。凡是不注 日期的 引用文 件，其最新版 本（包 括所有 的修 改单）适 用于本 文件。GB/T 6682 分析实验室用 水规格和 试验方 法 GB/T 8170 数值修约规则 与极限数 值得表 示和判 定 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1 部分：实验室 培养 基制备质 量保证 通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2 部分：培养基 性能 测试实用 指南 3 术语和 定义 下列术语 和定义 适用于 本文 件。3.1 动 物垫料 animal bedding 用于吸收 动物排 泄物，使 动 物保持舒 适生活 环境的 铺垫 物。包括动 物笼内 非直接 与 动物机体 接触的 铺垫物。3.2 菌 落总数 aerobic plate count 检样经 过处 理，在一 定条 件下（如培 养基、培 养温 度和培 养时 间等）培 养后，所得 每 g（cm2）检样中形成 的需 氧和 兼性 厌氧 微生物 菌落 总数。3.3 菌 落形成 单位 colony forming unit（CFU）在琼脂 平板 上经 过一 定温 度和时 间培 养后 形成 的每 一个菌 落，是计 算细 菌或 霉菌数 目的 单位。4 设备和 材料 4.1 恒温培 养箱：36 1。4.2 冰箱：2 5。DB15/T 1850 2020 2 4.3 恒温水 浴箱：46 1。4.4 天平：感量 为0.1 g。4.5 均质器。4.6 振荡器。4.7 无菌吸 管：1 mL（具 0.01 mL 刻 度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或 微量 移液 器及吸 头。4.8 无菌锥 形瓶：250 mL、500 mL。4.9 无菌培 养皿：直 径90 mm。4.10 pH 计或 pH 比色 管或 精密pH 试纸。4.11 放大镜 或/和菌 落计 数器。4.12 无菌规 格板：5 cm 5 cm。4.13 漩涡混 合器。4.14 无菌量 筒。4.15 无菌棉 签。4.16 无菌镊 子。4.17 无菌剪 刀。4.18 无菌滤 膜均 质袋。5 培养基 和试 剂 5.1 实验用 水：符 合GB/T 6682 的要 求。5.2 无菌生 理盐 水：见附 录 A.2。5.3 磷酸盐 缓冲 液：见附 录 A.3。5.4 平板计 数琼 脂培 养基：见 附录 A.4。6 操作步 骤 6.1 采样 6.1.1 采样原 则 样品采集 应遵循 随机性、代 表性的原 则。采 样过程 遵循 无菌操作 程序，防止一 切可 能的外来 污染。6.1.2 颗粒状 或粉 末状 样品 对送检样品包装 内 不 同 部位样 品 进 行 随 机 多 点 取 样 至少250 g，充 分 混 匀 后 称取25 g 颗 粒 状 或 粉末 状 垫料样品，加入225 mL 无菌稀释液（磷 酸盐缓 冲液或 生理 盐水），充分振 摇或均 质1 min 2 min，制成1:10的样品匀液。DB15/T 1850 2020 3 6.1.3 平面样 品 表1 不同面 积平 面类 垫料 样品 采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于0.25（含）25 1 0.25 0.5（含）50 2 0.5 0.75（含）75 3 大于0.75 100 4 稀释无 菌操 作将 灭菌 规格 板（5 cm 5 cm）放 在平 面 垫料表 面，用浸 有无 菌 稀 释液（磷酸 缓冲 液或生理盐 水）的棉 拭子，在 规格板 内来 回均 匀涂 抹整 个方 格 3 次，并 随之 转动 棉拭子，然 后用 灭菌 剪 刀 剪去棉拭 子与 手接 触的 部分，将棉 拭子 头置 入装 有25 mL 无 菌稀 释液 的无 菌锥 形 瓶中，根据 样品 面积 大小重复采 样1 4 个规 格板 面 积，采 样量 见表1，相应 地 将棉拭 子头 置 入 25 mL 100 mL 的 无菌 稀释 液中，充分振 摇制 成样 品原 液（1 mL 原 液对 应的 样品 面积 为 1 cm2）。取1 mL 样品 原液注 入含 有 9 mL 无菌 稀释液的 试管 中，制 成1:10 的样 品匀 液。6.2 稀释 6.2.1 取1 mL 1:10 样 品匀 液注 入 含有 9 mL 无菌 稀释 液 的 试 管中，另换 一 支1 mL 无 菌 吸管反 复吹 吸，或在旋 涡混 合器 上混 匀，此液 为 1:100 的 样品 匀液。6.2.2 按6.2.1 操 作，制 备 10 倍 递增系 列稀 释样 品匀 液。每递增 稀释 一次，换 用 1 支 1 mL 无 菌吸 管。6.2.3 根据对 垫料 样品 污染 状况 的估计，选 择 2 3 个适 宜 稀释度 的样 品匀 液，在进 行 10 倍递 增稀 释的同时，每 个稀 释度 分别 吸取 1 mL 样品 匀液 于2 个 无菌平 皿内；同 时分 别 取1 mL 无菌 稀释 液加 入2个无菌 平皿 作空 白对 照。6.2.4 及时 将20 mL 25 mL 冷却 至46 的 平板 计数 琼脂 培养基(可 置于46 1 恒温 水浴 箱中 保温)倾 注平 皿，并转 动 平 皿 使其混 合均 匀。置水 平台 面待培 养基 完全 凝固。6.2.5 如果样 品中 可能 含有 在琼 脂培养 基表 面弥 漫生 长的 菌落时，可 在凝 固后 的琼 脂表面 覆盖 一薄 层平板计 数琼 脂培 养基(约4 mL)，凝固 后翻 转平 板，再进行 培养。6.3 培养 琼脂凝固 后倒置 平板，置36 1 培养箱中 培养48 h2 h，观察并计数结 果。6.4 菌落计 数 6.4.1 用肉眼 观察，必 要时 可用 放大镜 或低 倍镜，记 录稀 释倍数 和相 应的 菌落 总数。以菌 落形 成单 位（colony-forming units，CFU）表 示。6.4.2 选取菌 落数 在30 CFU 300 CFU 之间、无 蔓延 菌落 生 长的平 板计 数菌 落总 数。低于 30 CFU 的平板记录 具体 菌落 数，大 于300 CFU 的 可记 录为 多不 可计。6.4.3 其中一 个平 板有 较大 片状 菌落生 长时，则 不宜 采用，而应 以无 片状 菌落 生长 的平板 作为 该稀 释度的菌 落数；若片 状菌 落 不到平 板的 一半，而其 余 一半中 菌落 分布 又很 均匀，即 可计 数半 个平 板菌 落 数后乘 以2，代表 该平 板菌 落数。6.4.4 当平板 上出 现菌 落间 无明 显界线 的链 状生 长时，则 将每条 单链 作为 一个 菌落 计数。DB15/T 1850 2020 4 7 结果与 报告 7.1 结果 7.1.1 若只有 一个 稀释 度的 两个 平板菌 落数 在30 CFU 300 CFU 时，计算 同一 稀释 度的两 个平 板菌 落数的平 均值，再 将平 均值 乘以相 应稀 释倍 数。7.1.2 若有两 个稀 释度 平板 上菌 落数均 在 30 CFU 300 CFU 时，按以 下公 式（1）计 算：d n nCN)1.0(2 1（1）式中：N 样品中菌落总 数；C 平板（含适宜范围 菌落数的 平板）菌落数 之和；n1 第一稀释度（低稀释 倍数）平 板个数；n2 第二稀释度（高稀释 倍数）平 板个数；d 稀释因子（第 一稀释 度）。7.1.3 若所有 平 板 上菌 落数 均大 于 300 CFU，则 对稀 释度 最高的 平板 进行 计数，其 它平板 可记 录为 多不可计，结 果按 平均 菌落 数乘以 最高 稀释 倍数 计算。7.1.4 若所有 平板 上菌 落数 均小 于 30 CFU，则 应按 稀释 度 最低的 平均 菌落 数乘 以稀 释倍数 计算。7.1.5 若所有 稀释 度（包括 液体 样品原 液）平板 均无 菌落 生长，则以 小 于1 乘 以最 低稀释 倍数 计算。7.1.6 若所有 稀释 度的 平板 菌落 数均不 在 30 CFU 300 CFU 之间，其 中一 部分 小于30 CFU 或大 于300 CFU 时，则 以最 接近30 CFU 或 300 CFU 的 平均 菌落 数乘以 稀释 倍数 计算，同 时应选 取稀 释倍 数较 低的平均菌 落 数 进行 计算。7.2 报告 7.2.1 菌落数 按“四舍五 入”原 则修约。菌 落数 在10 CFU 以内时，采 用一位 有效 数 字报告；菌落 数在 10 CFU 100 CFU 之 间时，采用 两位 有效 数字 报告。7.2.2 菌落数 大于 或等 于100 CFU 时，第3 位数 字采 用“四舍五 入”原则 修约 后，取前 2 位数 字，后面用 0 代替 位数 来表 示结 果；也 可 用 10 的指 数形 式 来表示，此 时也 按“四舍 五入”原则 修约，采 用两位有效 数字。具 体修 约规 则按 照 GB/T 8170 执 行。7.2.3 若空白 对照 平板 上有 菌落 出现，则此 次检 测结 果无 效。7.2.4 以CFU/g 或CFU/cm2为 单位 报告菌 落总 数。DB15/T 1850 2020 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）培养基 和试 剂 A.1 培养基 制备 及质 量保 证 按照SN/T 1538.1 和SN/T 1538.2 执 行，并对 制备 好的 培养基 进行 性能 测试，如 使用等 效的 脱水 合成培养基，使 用前 对其 进行 验收并 按其 说明 书使 用。A.2 生理盐 水 A.2.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 氯化钠加 入1000 mL 蒸馏水中，搅拌 至完全 溶解，分装 后，121 灭菌15 min，备用。A.3 磷酸盐 缓冲 液 A.3.1 成分 磷酸二氢 钾 34.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 贮存液：称取34.0 g 的 磷 酸二 氢 钾 溶 于500 mL 蒸 馏 水 中，用 大 约175 mL 的1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH至7.20.1，用蒸馏水稀释 至1000 mL 后贮存于冰箱。稀释液：取贮存 液1.25 mL，用蒸馏 水稀释 至1000 mL，分装于 适宜容 器中，121 高压灭 菌15 min。A.4 平板计 数琼 脂培 养基 A.4.1 成分 胰蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 2.5 g 葡萄糖 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL DB15/T 1850 2020 6 A.4.2 制法 上述各成 分加入 蒸馏水 中，加热溶解，调至pH至7.0 0.2。分装后，121 灭菌15 min，备用。_