ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.3 2020 新型冠 状病毒检 测技术规 范 第3 部分：核酸荧 光 PCR 检测 程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 3:Real-time fluorescence PCR test procedure 2020-03-02 发布 2020-03-03 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.3 2020 I 前 言 DB32/T 3762 新 型 冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分：第1部 分：生物 样本 采 集、运 输和 保存；第2部 分：病毒 分离 与 鉴定；第3部 分：核酸 荧光PCR 检测 程序；第4部 分：重组 酶介 导 等温扩 增程 序；第5部 分：血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附检 测 程序；第6部 分：血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序；第7部 分：空气 样 本 检 测与评 估；第8部 分：物体 表面 检 测与评 估；第9部 分：医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估。本部分 为DB32/T 3762 的第3部 分。本部分 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本部分 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出。本部分 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。本部分 起草 单位：江 苏省 疾病预 防控 制中 心、南京 医科大 学、苏州 第五 人民 医院、苏州 大学 附二 院、昆山市 疾病 预防 控制 中心。本 部分 主要 起草 人：崔 仑 标、朱宝 立、朱 小娟、葛 以跃、程 军平、徐佳 南、钱志远、罗晓 明、沈 欢喜。DB32/T 3762.3 2020 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第3 部分：核酸荧光 PCR 检 测程序 1 范围 本 部分 规定 了新 型冠 状病 毒 实验 室核 酸荧 光 PCR 检测 环境 与设 施、设备 与耗 材、试 剂与 材料、样本前处 理与 核酸 提取、扩 增体系 配制 与扩 增、结果 判定。本部分 适用 于新 型冠 状病 毒实验 室核 酸荧 光 PCR 检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅 注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 医疗机 构临 床基 因扩 增管 理办法 原 卫生 部办 公厅 医疗机 构临 床基 因扩 增检 验实验 室工 作导 则 原 卫 生部检 验中 心 新型冠 状病 毒实 验室 生物 安全指 南 国家 卫生 健康 委 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件 3.1 荧光 PCR real-time fluorescence PCR 一种新 型定 量试 验技 术，通过荧 光染 料或 荧光 标记 的特异 性的 探针，对PCR 产物进 行标 记跟 踪，实时在线 监控 反应 过程，结 合相应 的软 件对 产物 进行 分析，计 算待 测样 本模 板 的初始 浓度，用于 鉴别 病 原微生物。4 环境与 设施 4.1 实验室 资质 及级 别要 求 应按照 新型 冠状 病毒 实 验室生 物安 全指 南 的 要 求，未经 培养 的感 染性 材 料的操 作在 采用 可靠 的方法灭 活前 进行 核酸 提取 及临床 样本 的灭 活等 操作，应在 生物 安全 二级 实验 室（BSL-2）进行，同 时 采用生物 安全 三级 实验 室（BSL-3）的个人防 护；感 染 性材料 或活 病毒 在采 用可 靠的 方 法灭 活后 进行 的核酸检测操作应在BSL-2 进 行。核 酸 扩 增 应在 基 因 扩增 实 验 室 进 行,临 床检 测 机构 基 因 扩 增 实 验室 应 满 足GB 19489、医疗机构临 床基因扩增管理办法、医疗机构临床基因 扩增 检验实验室工作导则 相关要求。4.2 操作人 员资 质及 防护 要求 DB32/T 3762.3 2020 2 实验操 作人 员应 经过 生物 安全培 训并 取得 上岗 证，在身体 健康 状态 良好 的情 况下准 入。操作 人 员 按BSL-3级实验室个人防护 的要求进行防护，需 配备N95 及以上 级别防护口罩、医用无纺布帽、护 目镜 或防护面 屏、连体 防护 服、一次性 手术 衣、一次 性PE 手套、乳胶 手套、鞋套、防水靴 套 等 防护 装备。5 设备与 耗材 5.1 设备 生物安 全柜、离 心机、涡 旋振荡 器、水浴 或 金 属浴、核酸 提取 仪、荧光 定量PCR 仪。5.2 耗材 N95 及以 上防 护口 罩、医用 无纺布 帽、护 目镜、连 体 防护服、一次 性PE 手套、一次性 手术 衣、乳胶手套、防水 靴套、微 量移 液器及 各种 配套 带滤 芯Tip 头、1.5 mL EP 管、冻存 管、冻存 盒。6 试剂 与 材料 6.1 试剂 核酸提 取试 剂盒、新 型冠 状病毒 荧光PCR 检测 试剂 盒。6.2 材料 消 毒 剂：75%乙 醇；有 效 氯5500mg/L 的 消 毒 液（需 每 天 新 鲜 配 制）；生 理 盐 水 或 磷 酸 盐 缓 冲 液（PH=7.4）；4%NaOH 或 含1g/L 蛋白酶K 的磷酸盐 缓 冲液 或0.1%二硫 苏糖 醇 的 磷酸盐 缓冲 液。7 样本前 处理 与核 酸提 取 7.1 样本前 处理 7.1.1 进入 BSL-2 实验 室，需 由 两人同 时操 作。7.1.2 在生安 柜内 打开 第二 层包 装，取 出待 检样 本，核对 送检单，若 管壁 外有 不明 液体，应用 含氯 消毒液擦 拭。7.1.3 样本灭 活：56 水浴 或金 属浴灭 活 30 min。7.1.4 特殊样 本处 理：痰液 样本：加入检 测等 体 积 4%NaOH 或含 1g/L 蛋白酶 K 的 磷酸 盐缓冲 液 或 0.1%二硫苏 糖醇 的磷 酸盐 缓冲 液室温 放 置 15min 20 min 液化 痰液；粪 便样 本：以 生理盐 水或 磷酸 盐缓 冲液制备 10%的 便悬 液，轻轻 吹吸 3 5 次，静止 10 min，8000 rpm 离心 5 min，在 生物 安全 柜中 取上 清进行下 一步 试验。7.1.5 将样本 混匀 后分装于 2 mL 带螺旋 盖内 有垫 圈冻 存管。在冻 存管 上标 记，注明 姓名、样本 类型、日期等。吸 取部 分样 本进 行核酸 提取。所 有冻 存管 旋紧管 盖后 需用 封口 膜密 封。7.2 核酸提 取 7.2.1 核酸提 取按 照核 酸提 取试 剂盒或 核酸 提取 仪操 作说 明进行。7.2.2 取出提 取好 的核 酸，转 入 1.5 mL EP 管，注明 姓名、样本类 型、日期 等。7.2.3 将核酸 管放 入核 酸转 运盒，连同 样本 转运 盒进 行盒 内外消 毒后 转出 生安 柜。DB32/T 3762.3 2020 3 7.2.4 实验结 束后，生安 柜内 清 场：使用 后的 核酸 提取 条/板放入 垃圾 袋，包 扎垃 圾 袋，含氯 消毒 液喷洒消毒 外表 面，将一 次性 软吸收 垫喷 洒含 氯消 毒液 后折叠。手 消毒 后将 垃圾 袋和一 次性 软吸 收 垫 一 起 带出生安 柜放 入核 心区 中号 垃圾袋。试 管架，试 验台 面、移 液器 等喷 洒含 氯消 毒液消 毒 30 min 后用清 水擦拭。关闭 生安 柜，紫外 灯消 毒 30 min。7.2.4.1 消毒一 次性 手术 衣、脱一 次性手术 衣 放入 中号 垃圾 袋，包 扎垃 圾袋。消 毒垃 圾袋外 表面、核酸和样 本转 运盒。退 出核 心区，将中 号垃 圾袋 放入 缓冲区 大号 垃圾 袋内。7.2.4.2 每日固 定时 间对 核心 区进 行过氧 化氢 终末 消毒，消 毒前应 以塑 料袋 覆盖 机器 如核酸 提取 仪、离心机 等，记录 终末 消毒 记录。7.2.4.3 在缓冲 区按 合理 程序 脱卸 个人防 护用 品。脱内 层手 套前开 启核 心间 紫外 灯消毒 30 min。7.2.4.4 出缓冲 区，开启 缓冲 区紫 外灯消 毒。将垃 圾袋 放入 高压灭 菌器 中 121，30 min，并记录。7.2.4.5 将核酸 交核 酸检 测人 员。样本转 入病 毒样 本专 用专 人保管 冰箱。8 扩增体 系配 制 与 扩增 8.1 按所用 检测 试剂 盒说 明书 配制荧 光 PCR 扩 增体 系，至少建 立 2 套荧 光PCR 扩 增体系。8.2 在生安 柜内 加核 酸模 板，然后进 行荧 光PCR 扩 增。8.3 在实验 记录 本记 录加 样位 置和样 本编 号。8.4 未用完 核酸 样本 转入 病毒 样本专 用专 人保 管冰 箱。8.5 按所用 试剂 盒说 明书 在仪 器上设 置扩 增参 数进 行扩 增。9 结果判 定 9.1 阈值设 定 阈值设 定原 则以 阈值 线刚 好超过 阴性 对照 扩增 曲线 的最高 点，结果 显示 阴性 为准。9.2 质控标 准 9.2.1 样本内 参基 因要 求 样本内 参RNP 基 因出 现典 型的扩 增曲 线呈S 型，且Ct 值小于 或等 于35。9.2.2 一般要 求 检测结 果中 的阴、阳 性对 照均符 合以 下情 况，如对 照不成 立，此次 试验 视为 无效。9.2.3 阴性对 照 阴性对 照无 扩增 曲线，或Ct 值大于40。9.2.4 阳性对 照 阳性对 照出 现典 型的 扩增 曲线呈S 型，且Ct 值 小于 或 等于30。9.3 结果判 断 9.3.1 阳性判 定：实验 室确 认阳 性病例 需满 足以 下两 个条 件中的 一个：DB32/T 3762.3 2020 4 a)同一份 样本 中新 型冠 状病 毒 2 个靶 标（ORF1ab、N）实时 荧光 RT-PCR 检 测 结果均 为阳 性。如果出 现单 个靶 标阳 性的 检测结 果，则需 要重 新采 样，重 新检 测。如果 仍然 为单靶 标阳 性，判定为阳 性。b)两种不 同类 型样本 实 时荧 光 RT-PCR 同时 出现 单靶 标阳性，或同 种类 型样本 两 次采样 检测 中 均出现单 个靶 标阳 性的 检测 结果，可判 定为 阳性。9.3.2 阴性判 定：在 对照 成立 下，如 果样 本检 测没 有出 现 扩增曲 线，或 Ct 值 大于 40，则 判定 为阴 性。9.3.3 不确定 结果：在 对照 成立 下，如 果检 测样 本的 扩增 曲线不 典型，结 果不 确定，建议 重复。如 果核酸检 测结 果阴 性不 能排 除新型 冠状 病毒 感染，需 要排除 可能 产生 假阴 性的 因素，包括：样 本质 量 差，比如口 咽等 部位 的呼 吸道 样本；样本 收集 的过 早或 过晚；没有 正确 的保 存、运输和 处理 样本；技 术 本 身存在的 原因，如 病毒 变异、PCR 抑制 等。新型 冠状 病毒核 酸荧 光 PCR 扩 增结 果判断。_