ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4053 2020 新城疫病 毒基因 VII 型荧光 定量PCR 检测方法 Real-time PCR assay for the detection of genotype VII newcastle disease virus 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4053 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 东省 畜牧 兽医 局提出 并组 织实 施。本标准 由山 东省 畜牧 业标 准化技 术委 员会 归口。本标准 起草 单位：山 东省 农业科 学家 禽研 究所。本标准 主要 起草 人：孟凯、吴家 强、宋敏 训、袁小 远、张 玉霞、杨 金兴、艾 武、王 友令、亓 丽 红。DB37/T 4053 2020 1 新 城疫病 毒基 因VII 型荧光 定量 PCR 检测 方法 1 范围 本标准 规定 了新 城疫 病毒 基因VII型（NDV）荧 光定 量PCR 检测 方法。本标准 适用 于鸡 咽喉 和泄 殖腔拭 子及 脑、肺脏、脾 脏等组 织中 新城 疫病 毒基 因VII 型的 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 试验原 理 实时荧 光定量PCR检 测是 在PCR反应 体系 中，除 采用 特 异的引 物外，还加 入了与DNA 双链 非特异 性结合的SYBR Green I 荧 光染 料。当它 与DNA 双 链结 合时，发出荧 光，从DNA 双 链上 释 放出来 时，荧光 信号 急剧减弱。随着PCR反 应的 进 行，每 经过一 个循 环，收 集一次 荧光强 度信 号，这 样就可 以通过 荧光 强度变化监测 产物 量的 变化，从 而得到 一条 荧光 扩增 曲线。4 试剂或 材料 除非另 有说 明，在分 析中 仅使用 分析 纯的 试剂，水 为GB/T 6682 规 定的 一级 水。4.1 10 磷 酸盐 缓冲 液PBS：pH 值7.2。4.2 研钵。4.3 病毒RNA 提 取试 剂盒。4.4 SYBR Green I RT-PCR 缓 冲液。4.5 酶混合 物：内 含MLV 反转 录酶和 RNase Inhibitor。4.6 DNA 聚 合酶。4.7 阳性对 照：浓度 为1.0 105拷贝/L 的 阳性 质粒。4.8 阴性对 照：水。4.9 DEPC 水。5 仪器设 备 5.1 微量可 调移 液器：最 大量 程为 10 L、20 L、100 L、1 000 L。5.2 台式高 速冷 冻离 心机：最 高转 速 16 000 r/min。5.3 荧光定 量PCR 仪：温 度范 围 4.0 99.9。5.4 分析天 平：精度 为0.01 g。DB37/T 4053 2020 2 5.5 冰箱：规格 为 4 和-20。5.6 二级生 物安 全柜。6 引物 Forward Primer：5-CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3 Reverse Primer：5-GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3 注：Y=C 或T；R=A 或G；K=G 或T 7 样品 7.1 采集工 具 棉拭子，剪 刀，镊子，1.5 mL 离 心管。7.2 样品采 集 7.2.1 咽喉拭 子/泄殖 腔拭 子 7.2.1.1 咽喉拭 子采 样：将棉 拭子 深入喉 头来 回 刮 3 次，取 咽喉分 泌液，放 于含 抗生 素（青 霉素2 000 U/mL+链霉 素2 mg/mL）的10磷 酸盐 缓冲 液 PBS（pH 值7.2）的 1.5 mL 离心 管中。7.2.1.2 泄殖腔 拭子 采样：将 棉拭 子深入 泄殖 腔转 一圈 沾取 粪便（需有 可见 粪便），放 于含抗 生素（青霉素 10 000 U/mL+链霉 素10 mg/mL）的 PBS 中。7.2.2 组织样 品 待检禽 无菌 采集 脑、肺脏、脾脏 等组 织，装入 一次 性采样 袋或 其他 灭菌 容器，编号。7.3 样品运 输与 保存 样品放 于保 温箱 中加 冰，密封，24 h 内 送至 实验 室，如不能 立即 检测，需将 样 品放于-20 冰 箱保存。7.4 样品处 理 7.4.1 咽喉拭 子/泄殖 腔拭 子 将装有 咽喉 拭子/泄 殖腔 拭 子的1.5 mL 离心 管在 振荡 器上充 分混 合后，取 出棉 拭 子，4 条 件下5 000 r/min 离心10 min，取上 清 液转入 新的1.5 mL 离 心管 中，编 号备 用。7.4.2 组织样 品 将组织 置于 灭菌 的研 钵中，按照质 量体 积比（1:5 10）加入灭 菌PBS 进 行充 分研 磨，4 条 件下5 000 r/min 离心10 min，取上 清 液转入 新的1.5 mL 离 心管 中，编 号备 用。8 试验步 骤 8.1 病毒RNA 提取 DB37/T 4053 2020 3 提取RNA 时应 避免RNA 酶污 染。同 时设立 阳性 对照和 阴性对 照。用 病毒RNA 提 取 试剂盒，按照 说明 书步骤提 取待 检样 品RNA，-80 保 存备 用。8.2 荧光定 量PCR 反 应体 系 详见表1。表1 荧光定 量PCR 反 应体 系 试剂 使用量 酶混合物*0.4 L DNA 聚合酶 0.4 L SYBR Green I RT-PCR Buffer*10 L PCR Forward Primer(10 mol/L)0.4 L PCR Reverse Primer(10 mol/L)0.4 L Total RNA 2.0 L DEPC 水 6.4 L Total 20 L 每次均 应设 阴性 对照。*内含MLV 反 转录 酶和RNA 酶 抑制剂。*内含dNTP Mixture，Mg2+，荧光 染料SYBR Green。8.3 荧光定 量PCR 反 应程 序设 定 详见表2。表2 荧光定 量PCR 反 应程 序设 定 阶段 1：反转录反应 阶段 2：PCR 反应 阶段 3：溶解曲线分析 42，15 min 95，5 sec 95，5 sec 95，10 sec 60，45 sec（收集荧光）65，5 sec 1 Cycle 40 Cycle 95，5 sec 9 结果判 定 9.1 结果分 析条 件设 定 阈值设 定原 则：根据 仪器 噪声情 况进 行调 整，以阈 值线刚 好超 过阴 性对 照扩 增曲线 的最 高点 为 准。9.2 试验成 立条 件 9.2.1 阴性对 照 无Ct（或 Cp）值 并且无 扩增 曲线。（参见 附录A.1）9.2.2 阳性对 照 Ct（或 Cp）值 35，并 出现 特定 扩增 曲线。（参 见附 录A.2）9.2.3 如阴性 和阳 性对 照不 满足 以上条 件，此 试 验视 为无 效。9.3 结果描 述及 判定 9.3.1 阴性 DB37/T 4053 2020 4 无Ct（或Cp）值 并且 无扩 增曲线，表 明样 品中 无基 因VII 型新 城疫 病毒 核酸。9.3.2 阳性 Ct（或Cp）值35，且出 现特定 扩增 曲线，Tm 值为83.5，表 明样 品中 存在 基因VII 型 新城 疫病 毒核酸。（参 见附 录A.3）9.3.3 有效原 则 Ct（或Cp）值35的 样品 须复检，重 做结 果无Ct值 者为阴 性，否则 为阳 性。DB37/T 4053 2020 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）荧光定 量标 准曲 线参 考图 阴性曲 线图 见图A.1。图A.1 阴性曲 线图 阳性曲 线图 见图A.2。图A.2 阳性曲 线图 DB37/T 4053 2020 6 溶解曲 线图 见图A.3。图A.3 溶解曲 线图 _