ICS 11.020 C 62 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.10 2020 新型冠状 病毒检测 技术规范 第 10 部分：微量血 清中和试 验 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 10:Serum microneutralization test 2020-07-29 发布 2020-07-30 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.10 2020 I 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分：第1部 分：生物 样本 采 集、运 输和 保存；第2部 分：病毒 分离 与 鉴定；第3部 分：核酸 荧光PCR 检测 程序；第4部 分：重组 酶介 导 等温扩 增程 序；第5部 分：血清IgM 和IgG 抗体 酶联 免疫 吸附 检测 程序；第6部 分：血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层 析检 测程序；第7部 分：空气 样 本 检 测与评 估；第8部 分：物体 表面 检 测与评 估；第9部 分：医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估；第10部 分：微量 血清 中和试 验；第11部 分：全基 因组 高通量 测序。本部分 为DB32/T 3762 的第10部 分。本部分 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本部分 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出。本部分 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。本部分 起草 单位：江 苏省 疾病预 防控 制中 心、南京 医科大 学、苏州 第五 人民 医院、苏州 大学 附二 院、昆山市 疾病 预防 控制 中心。本 部分 主要 起草 人：葛以 跃、崔 仑标、迟 莹、郭喜 玲、陈 银、朱宝 立、程军 平、钱 志远、罗 晓 明、沈欢喜。DB32/T 3762.10 2020 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第 10 部分：微量 血清中 和 试验 1 范围 本部分 规定 了新 型冠 状病 毒微量 血清 中和 试验 环境 与设施、设 备与 耗材、试 剂与材 料、操作 步 骤、结果判 定和 清场 与消 毒。本部分 适用 于新 型冠 状病 毒实验 室微 量血 清中 和试 验。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。新型冠 状病 毒实 验室 生物 安全指 南 中华 人民 共和 国国家 卫生 健康 委员 会 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件 3.1 微量血清 中 和试 验 serum microneutralization test 将病原 体及 其产 物（毒素）与免 疫血 清相 混合，在 体内或 体外 检测 其致 病力 的试验，用 以检 查 动 物的免疫 状态，测 定抗 原滴 度，以 及病 原鉴定 等。3.2 细胞病 变效 应 cytopathic effect，CPE 病毒在 宿主 细胞 内大 量增 殖，导 致细 胞病 变甚 至死 亡的现 象。大多 数病 毒感 染敏感 细胞 培养 都 能 引起其显 微镜下 表现 的 改变，如细胞 聚集 成团 肿大 圆缩 脱落及 细胞 融合 成为 多核 细胞，细胞 内出 现包 涵体，乃至细 胞裂 解等。3.3 半数组 织培 养感 染剂 量 median tissue culture infective dose(TCID50)能 在培 养板 孔或 试管 内 引 起半数 细胞 病变 或死 亡所 需的病 毒量，用 以表 征病 毒的滴 度。4 环境与 设施 4.1 实验室 资质 及级 别要 求 DB32/T 3762.10 2020 2 应符合 新型冠状 病毒实验室生物安全指南 的要求，病毒培养包括 病毒的分离、培养、滴定、中和试 验等 实验 操作 应当 在生物 安全 三级 实验 室（BSL-3）的生物安 全柜 内进 行。实 验室 开展 相关 活动前，应 当报 经国 家卫 生健 康委批 准，取得 开展 相应 活动的 资质。4.2 操作人 员资 质及 防护 要求 实验操 作人 员应 经过 生物 安全培 训并 取得BSL-3实验活动上 岗证，在 身体 健康 状态良 好的 情况 下 经实验室主任 批准后方可开展活动。操作人员应 根据 新型冠状病毒实验室生物安全指南 要求，按照BSL-3 个人 防护 的要 求进 行 防护。5 设备与 耗材 5.1 设备 生物安 全柜、离 心机、倒 置显微 镜、涡旋 器、冰箱、CO2培 养箱 等。5.2 耗材 N95 及以 上防 护口 罩、医用 无纺布 帽、护 目镜、连 体 防护服、一次 性PE 手套、一次性 手术 衣、乳胶手套、防水 靴套、微 量移 液器及 各种 配套 带滤 芯Tip 头、一 次性 平皿、离 心管、96孔 细胞 培养 板等。6 试剂与 材料 6.1 试剂 6.1.1 Hanks 溶 液（每毫升 含青 霉素、链霉 素 各 2000 单位）6.1.2 DMEM 培 养液（含 10%胎 牛血清）。6.1.3 DMEM 维 持液（含 2%胎 牛血清）。6.1.4 消化液（0.25%胰酶 和 0.025%EDTA-Na2混合 液）。6.2 材料 6.2.1 已滴定 的新 型冠 状病 毒悬 液。6.2.2 阳性对 照血 清、阴性 对照 血清（正常 血清）及 待检 血清。6.2.3 非洲绿 猴肾 传代 细胞（VERO-E6）、人 呼吸 道上 皮细 胞、人肝 癌细 胞（Huh7）或其它 敏感 细胞。7 试验技 术要 点 7.1 确定实 验室 质量 控制 标准 的新型 冠状 病毒 病毒 株滴 度，应 至少 有三 次独 立的 滴度水 平测 定结 果，三次实 验结 果的 滴度 波动 不应超 过+/-0.5。7.2 中和抗 体滴 度的 判定 是以 比较病 毒受 免疫 血清 中和 后的残 存感 染力 为依 据，因此设 置对 照实 验十分重要。7.3 采用固 定病 毒 稀释 血清 的方法 进行 微量 中和 试验。8 操作步 骤 8.1 实验前 准备 DB32/T 3762.10 2020 3 8.1.1 将实验 所需 细胞 置 37 5%CO2培 养箱 培养 至单 层，在 进入 BSL-3 接种病毒 前，弃掉 细胞 培养液，用 Hanks 溶液 洗 3 次。8.1.2 配备消 毒液：75%乙 醇、有效 氯 5500 mg/L 的含氯 消毒 液。8.1.3 将细胞、病 毒、血清、试 剂和耗 材一 次性 带 入 BSL-3 核心 区。8.2 血清稀 释 8.2.1 血清的 处理：将 待测 血清、阳性 对照 血清 及阴 性对 照血 清 56 水 浴灭 活 30 min，为防止管 盖崩开，要用 封口 膜封 管口。待冷 却后 移至 生物 安全 柜内进 行稀 释。8.2.2 在生物 安全 柜里，将 待测 血清、阳性 对照 血清 及阴 性对照 血清 用 DMEM 维 持液做 倍比 稀释，使其稀 释度 分别 为 1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128，每 管 量为 0.5 ml。每一稀释 度必 须更换吸头，吹 打混 匀。8.3 病毒稀 释 在生物 安全 柜里，用 DMEM 维持 液稀 释病 毒至 100TCID50/0.1ml。8.4 血清与 病毒 结合 8.4.1 在上述 各稀 释的 血清 管内 加 0.5 ml 病毒稀 释液（100TCID50/0.1ml），充 分混 匀，拧 紧管 盖，用封口 膜封 口后 置 37 水浴 1 h。8.4.2 病毒对 照 为 0.5 ml 病毒稀 释液（100TCID50/0.1ml）加 0.5 ml 的维持 液，同样 用封口 膜封 口 后置 37 水浴 1 h。8.4.3 正常细 胞对 照不 加病 毒，仅含 DMEM 维 持液。8.5 接种细 胞 8.5.1 弃去细 胞培 养孔 中 的 Hanks 液。8.5.2 将每个 稀释 度的 血清 病毒 混合物 接种 到单 层细 胞上，每一 稀释 度接 种 4 孔，每孔 0.2 ml。8.5.3 将接种 好样 品 的 96 孔培 养 板置 37 5%CO2培养 箱 中培养。8.6 结果观 察 每24 h在 倒置 显微 镜下 观 察细胞 形态 变化（CPE），并记 录结 果，观察5 d7 d，以0%25%细胞CPE 变 化为，26%50%细胞CPE 变 化为，51%75%细胞CPE 变化为，76%100%细胞CPE 变 化为，正常 细胞形 态为-。以病 毒对 照出现 时，结束试 验。9 结果判 定 9.1 质控要求 正 常细 胞对 照孔 应该 有完 整的细 胞单 层，病 毒对 照 孔应出 现 的CPE 变 化；能 够阻 止 产生CPE 的阳性 对照 血清 可 以中和 病毒 的感 染性，故 阳性对 照血 清孔 应无CPE，与正 常细 胞对 照孔 相 同；阴性对 照血 清孔 的CPE 情 况应与 病毒 对照 孔相 同。9.2 50%血清中和终点的计算 50%血清中和终点为能保护50%细 胞 不 产 生 病 变 的 血 清 最 高 稀 释 度，即 为 中 和 终 点，可 按Reed-Muench 法计 算结 果，参见表1。DB32/T 3762.10 2020 4 表1 某新型 冠状 病毒 病人 恢复 期血 清50%血清 中和 终点 的计算 血清稀释度 细胞病变管数/总管数 细胞 病变分布 累计 阳性 比例 阳性率（%）（+）管（-）管（+）（-）1:4（10-0.6)1:8(10-0.9)1:16(10-1.2)1:32(10-1.5)1:64(10-1.8)1:128(10-2.1)0/4 0/4 0/4 1/4 3/4 4/4 0 0 0 1 3 4 4 4 4 3 1 0 0 0 0 1 4 8 16 12 8 4 1 0 0/16 0/12 0/8 1/5 4/5 8/8 0 0 0 20 80 100 注1：计算公式为：lg50%血清中和终点=b+d c,b 为小于50%阳性率血清稀释度的对数，d 为距离比例，c 为稀释系数的对数，其中d=（50小于50%的阳性率）/（大于50 的阳性 率小于50%的阳性率）。注2：本例中：d=(50 20)/(80 20)0.5，lg50%血清中和终点=-1.5+0.5(-0.3)=-1.65，-1.65 的反 对数为1:45，既1:45的血清可保护50%细胞不产生病变。10 清场与 消毒 10.1 操作结 束后，及 时清 理生 物安全 柜内 的物 品，用 75乙醇 擦拭 外表 面后，移 出生物 安全 柜。10.2 将实验 过程 产生 的所 有污 染材料 经 121，30 min 高压消 毒灭 菌处 理。10.3 用新鲜 配制 的有效氯 5500 mg/L 的含氯消毒液 擦拭 工 作台面、生物 安全 柜内 壁 及台面，不要 擦拭顶棚，作用 后用 清水 擦拭 以除去 残余 消毒 液，关闭 生物安 全柜，紫 外灯消毒 30 min。10.4 按照合 理程 序 在 指定 脱卸 区域 脱 卸个 人防 护用 品，退出 BSL-3，填写 BSL-3 相关实 验记 录。_