ICS 65.020.40 B 61 DB51 小熊猫亲 子鉴定技 术规范 四 川 省 地 方 标 准DB51/T 26492019 2019-12-17发布 2020-01-01实施四 川 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语与定义.1 4 样品采集与保存.1 5 DNA 的提取与保存.2 6 微卫星标记选用.3 7 实验流程.3 8 亲子鉴定数据的管理.4 附录A（规范性附录）小熊猫样品采集记录表.5 附录B（规范性附录）小熊猫微卫星标记信息表.6 DB51/T 2649 2019II 前 言 本标准根据:GB/T1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写起草。本标准附录 A、附录B为规范性附录。本标准由四川省林业和草原局提出并归口。本标准由四川省市场监督管理局批准。本标准起草单位：成都大熊猫繁育研究基地。本标准主要起草人：张亮、侯蓉、张志和、沈富军、张文平、兰景超、杨旭煜、古晓东、黄祥明、吴孔菊、李明喜、陈玲、吴里霞、杨智、罗娌、杨奎兴、卓贵富、谢军金、刘红、刘佳文、王涓、黄文俊。DB51/T 2649 20191 小 熊猫亲 子鉴定技 术规范 1 范围 本标准规定了小熊猫亲子鉴定有关术语定义、DNA提取保存、亲子鉴定、个体识别的技术。本标准适用于四川省圈养小熊猫亲子鉴定、个体识别、遗传多样性评估和遗传档案建立。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。CJJ/T 263-2017 动物园动物管理技术规程 3 术语与 定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 微卫星 标记 Microsatellite marker 基因组中的简单串联重复DNA片段。3.2 DNA 样品 DNA samples 是指利用小熊猫组织、血液或粪便提取的小熊猫基因组DNA。3.3 微卫星 个体 识别 Microsatellite Individual identification 采用微卫星技术进行个体识别，以确认个体身份。3.4 微卫星 亲子 鉴定 Microsatellite Paternity testing 是采用微卫星技术，根据遗传性状在子代和亲代之间的遗传规律，判断亲代和子代之间是否亲生关系的鉴定。3.5 微卫星 分型 Genotyping 是指在对样品进行微卫星位点PCR扩增后，利用测序技术测定个体基因型。4 样品采 集与 保存 DB51/T 2649 20192 4.1 采样范 围 需鉴定的子代及其所有疑是父母。4.2 采样工 具 一次性橡胶手套、EDTA抗凝采血管、采样登记表、采样箱、冰袋等。4.3 血液及组 织样品 采集 采集小熊猫血液样品时，佩戴一次性橡胶手套。动物保定后，确认身份信息。采用EDTA抗凝采血管采集血液后贴上编号，并立即颠倒采血管3-5次，放入装有冰袋的采样箱中。小熊猫组织样品采集后分装，并在采样管上贴上编号，冷冻保存。4.4 粪便样 品采 集 小熊猫采样前应转移到单间或转运笼中隔离，避免粪样混淆。样品需新鲜粪便。采集样品时，应佩戴一次性手套，禁止用手直接触碰粪便。采集的样品装入无菌采样袋，放入装有冰袋的采样箱中。同一堆粪便尽量多取样品，以3-5团为佳。为避免样品间的交叉污染，每次采样必须更换手套。4.5 样品记 录与 编号 在采集样品时，填写小熊猫样品采集记录表（附录A）。记录采样时间、地点、动物编号、性别、年龄、来源以及动物体况特征等。在采血管/采样袋和采样表上同时贴上编号。4.5.1 有 电子 芯片 标记 血液样品采集编号规则：动物园首写字母（三位）+B（血液样品）+电子芯片号，如“CDZ-B-756876521”表示成都动物园血液样品，电子芯片号756876521。粪便样品采集编号规则：动物园首写字母（三位）+F（粪便样品）+电子芯片号，如“CDZ-F-756345687”表示成都动物园粪便样品，电子芯片号756345687。4.5.2 无 电子 芯片 标记 血液样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位）+B（血液样品）+样品号或动物呼名，如“CDZ-B-001”表示成都动物园001号个体的血液样品，“CDZ-B-小黑”表示成都动物园小黑的血液样品。粪便样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位）+F（粪便样品）+样品号或动物呼名，如“CDZ-F-001”表示成都动物园001号个体粪便样品，“CDZ-F-小黑”表示成都动物园小黑的粪便样品。5 DNA 的提 取与 保存 样品采集后冷藏保存。血液保存温度4，组织和粪便保存温度-20。样品采集后应尽快进行DNA提取。5.1 样 品的 DNA 提取 使用样品对应的专用商品试剂盒或传统分子生物学技术手段进行DNA提取。5.2 DNA 的保 存 DB51/T 2649 20193 近期使用的DNA，装有DNA的离心管保存于-20冰箱中。长期保存的DNA，装有DNA的离心管保存于-80超低温冰箱中。6 微卫星 标记 选用 6.1 亲子鉴 定 进行小熊猫亲子鉴定时，在26个微卫星标记中选择使用（附录B），其中1-11号为基本标记，12-26号为备选标记。当基本标记不能成功进行亲子鉴定时，考虑继续使用备选标记。6.2 个体识 别 进行小熊猫个体识别时，在10个微卫星标记中选择使用（附录B），其中1-5号为基本标记，6-10号为备选标记。当基本标记不能成功进行个体识别时，考虑继续使用备选标记。7 实验流 程 7.1 DNA 质量 检测 使用微量分光光度计对每个DNA样品进行浓度分析。血液样品260/280在1.8-2.0之间，粪便样品260/280在1.7-2.1之间，浓度超过50ng/ul的DNA样品合格。不在范围内的DNA样品不合格。质量不合格的DNA样品后续不能使用。7.2 PCR 微卫 星标 记 7.2.1 PCR 引物 的设 计、合成与 荧光 标记 使用的26个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录B，将序列送有关生物公司合成，并进行荧光标记。详细记录引物合成的公司名称、合成批次及每个引物标记的类型，方便后续做系统误差校正。7.2.2 PCR 扩增 的反 应体 系和扩 增程 序 表1 PCR 扩增 的反 应体 系 试剂 用量 L 10PCR buffer 2.0 MgCl2(25mmol/L)1.6 dNTP(2.5mM)0.6 Taq polymerase(2.5U/L)0.2 引物-F（15pmol/L）0.4 引物-R（15pmol/L）0.4 模板DNA（20ng/L）2.0 ddH2O 12.8 DB51/T 2649 20194 合计 20 PCR扩增程序：95预变性10分钟；95变性15秒，退火（退火温度根据具体的引物确定）15秒，72延伸30秒（10个循环）；然后89变性15秒，退火（退火温度根据具体的引物确定）15秒，72延伸30秒（25个循环）；最后72延伸10分钟。PCR产物4保存。7.2.3 PCR 产 物的 质量 检测 当PCR扩增完成后，取PCR产物5L，经1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小正确，表明PCR扩增成功；将符合质量要求的PCR产物避光（使用锡箔纸盒）存放于4冰箱，用于基因分型；对于不符合质量要求的样品，要对样品DNA进行纯化，并重新进行PCR扩增和质量检测；如果还是不能满足要求，则需要重新采集动物血液或粪便样本进行检测。7.3 微卫星 分型 将符合质量要求的PCR产物送有关实验室进行基因扫描分型。不同颜色标记引物的PCR产物或者相同颜色标记但PCR产物长度明显不重叠的可以混合后进行基因扫描分型。为消除系统误差，所有样品使用同一型号分型设备进行基因分型，所有批次都选用相同分子内标，并且使用同一数据判读软件进行数据判读。详细记录上述信息，方便后续做系统误差校正。同一批样品或同一地样品分两/多批次检测的，需使用一个已检测过有分型数据的样品同时进行扩增，进行质量控制，以避免数据误差。为了获得更加可信的基因型，最好进行多管重复实验。粪便DNA要求满足5管PCR重复。7.4 微卫星 分型 数据 的应 用 7.4.1 亲子 鉴定 用生物学软件对微卫星位点的分型数据进行亲子鉴定，并根据软件说明书判断分析结果是否采信。对未鉴定出父本或母本的，扩大疑是父母范围，进行样品采集、PCR扩增和基因分型，以进一步确认。7.4.2 个体 识别 用生物学软件对微卫星位点的分型数据进行个体识别；当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体；当两个样品的微卫星标记分型结果中有两个及以上标记分型结果不同时，判定样品来自不同个体；当两个样品的微卫星标记分型结果中只有一个标记差异时，对出现差异的位点重复PCR扩增（2-3次）和基因分型，以进一步确认。重复扩增后，若两个样品的分型结果没有差异，则判定样品来自同一个体；若仍存在标记差异，则认为两个样品来自不同个体。所有微卫星标记的分型数据均可用于遗传多样性评估。8 亲子鉴 定数 据的 管理 对圈养小熊猫进行个体识别、亲子鉴定等种群遗传管理时，应统一使用本标准规定的分子标记。各保护机构获得本机构相关数据，并妥善保存。DB51/T 2649 20195 A 附 录 A（规范 性附 录）小熊猫 样品 采集 记录 表 表A.1 小 熊猫 样品 采集记 录表 采样人：采样日期：圈舍 编号 房间号 出生 年月 性别 呼名 来源 样品 种类 样品编号 电子芯片 注射日期 采样量 亚种 信息 动物体况 特征 兽 1 左一 2018.3 雌 胖子 圈养 血液 CDZ-B-756876521 2019.5.10 3ml 川西 亚种 健康，尾巴少半截 兽 2 左二 2014.7 雄 小黑 野生 粪便 CDZ-F-756345687 2018.10.15 5 团 指名 亚种 健康，左耳尖有一撮白毛 DB51/T 2649 20196 B 附 录 B（规 范性 附录）小熊猫 微卫 星标 记信息 表 表B.1 小熊猫 微卫 星标 记信息 表 编号 标记名称 引物序列 5-3 退火温度 核心序列 长度 bp 参考文献 1 Aifu-01 F:CCTGCATCAGACTCAGCA 57(ATAG)12 126-178 Liang et al.,2007 R:GGTATCAGACGTGGGAACTA 2 CRP267 F:ACTCTACTATGATTCTGCCTATTT 53(TTTC)9 200-250 杨艾琳等，2019 R:TGAAGGTTATCTCAGGGTTT 3 Aifu-04 F:TTATTTTTTTATGGCTGAGTTA 56(GATA)15 231-255 Liang et al.,2007 R:GCACTGCTAGTTATTTACCC 4 CRP30 F:TGAGGGCATTTGATTTACC 53(CTAT)16 370-420 杨艾琳等，2019 R:AGAGTGAACTGGAATGGGAG 5 Aifu-06 F:CTCTAACAGTTTCCCATT 50(GATA)16 205-253 Liang et al.,2007 R:TGTGACCTAAACTACAGAT 6 CRP56 F:TTCCCAACTTTCTTCTCTTTC 54(TTTA)16 290-340 杨艾琳等，2019 R:AACCAACCCAGTGACATCTT 7 Aifu-22 F:CACGTTGGCTTCAGTAACA 55(TAGA)10 323-355 Liang et al.,2007 R:GGTTCGGATAAAGTATTGTGG R:CCTTGATTTGTTGGAGCATT 8 Aifu-23 F:GGACCCAACAAGCCCTTTACT 63(TATC)13 133-161 Liang et al.,2007 R:TTCTCTCTCAGCCTCTCACCCT 9 CRP41 F:AACCTCTGTCCTCCTCCATC 56(ATAA)13 140-190 杨艾琳等，2019 R:GCACAATGGTTTAGGCTTTT R:ACGGGTCAGAGTCAGAGGAG 10 CRP84 F:AAGTTGAAATGCCCGAGTTG 59(GTAA)10 350-400 杨艾琳等，2019 R:TTGCTGGTAGTTGTAGTAATGGTG 11 CRP240 F:TGATTCAAGGTTCCCTATGT 56(AAAC)11 160-210 杨艾琳等，2019 R:AAGAAAGTGGTTAGTTTAAATGTT 12 CRP381 F:AATGTCAAGGAAGAACCCAA 54(TCTA)12 240-290 杨艾琳等，2019 R:TTCACTGCTCACCGTTTCTA 13 Aifu-05 F:GAATAATGAGCTTGCCTTCC 57(GATA)13 328-348 Liang et al.,2007 R:TTGACATTGGCTATGTGAACA 14 CRP335 F:GACTCTTGGTTTCAGGGTTC 55(AAACA)9 220-270 杨艾琳等，2019 R:TCTACACTGGACCATTTTTGATA 15 CRP117 F:CCAAACCAAGATTCCCTC 54(TGA)12 240-290 杨艾琳等，2019 R:CTTATGCTCTTTCTCCTCCT DB51/T 2649 20197 表B.1 小熊 猫微 卫星 标记 信 息表（续）编号 标记名称 引物序列 5-3 退火温度 核心序列 长度 bp 参考文献 16 CRP442 F:TTCATGTCCTTTTGGATTGC 56(TCAT)11 240-290 杨艾琳等，2019 R:CCTCTTTTACCTCTGCCTCC 17 CRP71 F:AGAGTATCTCGGAAACTGAAA 53(TTTA)9 350-400 杨艾琳等，2019 R:GCATTAGGGCAAGGATTT 18 CRP35 F:TGCGGTGTATTCAGGTAAGC 58(AAAACA)9 300-350 杨艾琳等，2019 R:TCTTTGAACCCTCAGCCACT 19 CRP260 F:GGGGCCTTGTCTAATTCTGT 58(GAAT)9 200-250 杨艾琳等，2019 R:TCACTCCTGGTGCTGGTCT 20 CRP01 F:TTTTCCTCCCATAACC 46(TATC)10 320-370 杨艾琳等，2019 R:TTTGAATAGGGCAAGATA 21 Aifu-02 F:GACCCAGCCCTAACTCAAA 61(CTAT)11 120-144 Liang et al.,2007 R:FAM-CCTGCATTAGGCTCCACA 22 CRP194 F:AGTGTCTGAAAAATGGAGATGAA 55(GAAG)10 320-370 杨艾琳等，2019 R:TTACCAGGTCCAAGAAGCAC 23 CRP429 F:TAGGGTTCAAGCTCTTACTTAGTC 55(TCTA)11 200-250 杨艾琳等，2019 R:AGCAAACTGTTCTACCACTTCTC 24 Aifu-24 F:AGAGGGAAGTCTGCTTGAA 60(TATC)10 225-243 Liang et al.,2007 R:CATGGCATAGTGAGCTGGT 25 CRP404 F:GTTCCCTGTAGTTTCATCCC 55(ATTC)9 360-410 杨艾琳等，2019 R:TTTGTTTGCCATTGTATTCC 26 CRP367 F:TCCATGTAAGCCTCCAAACT 54(TAGA)11 240-290 杨艾琳等，2019 R:AGAACCAAATGTCTCCACGT _ DB51/T 2649 2019