ICS 65.020.20 B 30 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB 36/T 13062020 脱毒芋原原种生产技术规程 Technique regulation for pre-elite propduction of virus-free taro 2020-11-09发布 2021-04-01实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 13062020 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 组培准备.1 5 培养基制作.2 6 材料选取.2 7 茎尖脱毒培养.2 8 脱毒苗增殖.3 9 脱毒种茎诱导.3 10 脱毒种茎移栽.3 11 脱毒种茎贮存.3 附录 A（规范性附录）MS培养基母液配方及配制.5 附录 B（规范性附录）植物生长调节物质母液配制.6 附录 C（规范性附录）MS培养基配制.7 DB36/T 13062020 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件主要起草单位：江西农业大学、江西省江天农业科技有限公司。本文件主要起草人：周庆红、朱强龙、单楠、孙静宇、黄英金、方加军、刘星月、张宏玉、周四红。DB36/T 13062020 1 脱毒芋原原种生产技术规程 1 范围 本文件规定了脱毒芋原原种生产技术的组培准备、培养基制作、材料选取、茎尖脱毒培养、脱毒苗增殖、脱毒种茎诱导、脱毒种茎移栽、脱毒种茎贮存等要求。本文件适用于脱毒芋原原种的生产。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，凡注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 29378 马铃薯脱毒种薯生产技术规程 DB36/T 919 绿色食品 红芽芋 DB36/T 921 红芽芋脱毒种芋繁育技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 脱毒苗 Virus-free seedlings 应用茎尖组织培养技术获得的，经检测确认不带芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的芋试管苗。3.2 原原种 Pre-Elite 脱毒芋在防虫网室内无菌营养基质条件下培养生产出来的、不带病毒、类病毒的用于繁殖原种的种芋。4 组培准备 4.1 仪器设备 4.1.1 培养基制作及灭菌设备：天平、纯水机、酸度计、高温高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。4.1.2 无菌操作设备：超净工作台、灭菌器等。4.1.3 培养室设备：空调、定时器、培养架、摇床、光照培养箱、人工气候室等。4.1.4 药品储存与配制设备：冰箱、万分之一天平等。DB36/T 13062020 2 4.1.5 观察分析仪器：解剖镜、显微镜、切片机等。4.2 常用器皿及器材 4.2.1 培养器皿：试管、锥形瓶、培养皿及各类专用培养瓶。4.2.2 盛装器皿：烧杯、试剂瓶。4.2.3 计量器皿：量筒、容量瓶。4.2.4 操作器材：培养基分注器、细菌过滤器、镊子、剪刀、解剖刀。4.3 常用化学试剂 包括组培苗基本培养基所需的无机盐类、有机物类及植物生长调节物质类等。MS基本培养基成分及母液配制参见附录A；其它常用试剂及植物生长调节物质的配制参见附录B。5 培养基制作 5.1 培养基配制 制作培养基前需先配制MS基本培养基母液（配方及配制方法见附录A），配好后4保存（保存期不超过180d）。采用附录C方法配制好固体MS培养基，组培瓶分装后放入高温高压蒸汽灭菌锅（0.1 Mpa，121）灭菌20min，取出冷却凝固后备用。5.2 培养基配方 5.2.1 茎尖成苗培养基：MS+2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉，pH 5.8，固体培养基。5.2.2 组培苗增殖培养基：MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L 琼脂粉，pH 5.8，固体培养基。5.2.3 脱毒种茎诱导培养基：MS+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+80 g/L 蔗糖+7 g/L琼脂粉，pH 5.8，固体培养基。6 材料选取 选择具备红芽芋、花果芋和登龙粉芋等多子芋品种典型性状的株系，挑选植株健壮、长势良好的子芋球茎作为诱导材料。7 茎尖脱毒培养 7.1 茎尖剥离 7.1.1 选取符合品种特性、形状规则的子芋带芽球茎，切下 0.5 cm左右的顶芽或侧芽，剥下外层鳞片2 层3 层，清水冲洗干净。7.1.2 将芽置于干净烧杯中，在超净工作台上进一步消毒（75%酒精浸泡45s，无菌水冲洗，0.1%氯化汞浸泡 8min，无菌水冲洗干净）。DB36/T 13062020 3 7.1.3 将消毒后的芋芽置于解剖镜操作台，用镊子和解剖刀片对芋芽茎尖进行剥离，一手用镊子固定芋芽，一手用解剖刀片进行鳞片剥离，直至将鳞片剥离至 0.2mm0.4mm可见近似球形茎尖，用解剖刀片挑起剥离好的茎尖，接种于试管内茎尖成苗培养基中。7.2 茎尖培养 将接种茎尖的试管培养基放置于人工气候培养箱中培养（25，54 molm-2s-1，14 h/d），待茎尖生长30d后，将已开始分化茎尖移至装有茎尖成苗培养基的组培瓶中继续培养成苗。7.3 组培苗病毒检测 茎尖培养的组培苗在诱导增殖之前进行病毒检测，芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）等病毒，可采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测法（DAS-ELISA）和（或）反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测法，具体检测方法参照GB/T 29378执行。然后送到国家法定植检部门复检认定，没有检出DsMV和CMV等病毒的脱毒苗，即为脱毒苗。可对脱毒苗进一步进行增殖扩繁。8 脱毒苗增殖 8.1 切取 将合格脱毒苗基部自发根系切离。8.2 增殖 将其转接到组培苗增殖培养基上培养，培养30d后，将增殖的芽再继续切成单芽在增殖培养基上继代培养。8.3 扩繁 每继代1次单芽可增殖5个7个，每株脱毒苗继代扩繁5次后，可获得3000株4000株脱毒苗。9 脱毒种茎诱导 9.1 转接 选取株高4 cm 5 cm的健壮试管苗，将茎基部自发根系切除，转接到脱毒种茎诱导培养基上培养。9.2 培养 在室温为25，光照强度为54 molm-2s-1，环境相对湿度为60%和光周期为昼夜14h/10h条件下培养7d后，可见脱毒苗基部膨大。9.3 收获 试管芋生长40d50d后，发育到纵径1.0 cm，横径0.5 cm以上时，即可收获。10 脱毒种茎移栽 DB36/T 13062020 4 收获时将试管芋从培养瓶中取出，用清水洗净表面附着的培养基，种植在灭菌后的草炭+蛭石（2:1）的营养基质中，在设置光照强度为80 molm-2s-1，昼夜温度28/20，相对湿度为70%，光周期为昼夜16h/8h的人工气候培养室中培养成苗，当年收取地下微球茎，作为芋原原种。11 脱毒种茎贮存 从培养基上收获的试管芋洗净后，于阴凉处晾干，再贮藏于透气的容器中，置于4C条件下保存。试管芋经检验合格后，方可作为芋繁育用种。DB36/T 13062020 5 A A 附 录 A（规范性附录）MS培养基母液配方及配制 表A.1 MS 培养基母液配方及配制 母液 成分 用量 定容 每升用量 NH4NO3 82.5 g KNO3 95.0 g 母液1（50 倍）MgSO47H2O 18.5 g 1000 mL 20 mL 母液 2（100 倍）CaCl2H2O 44.0 g 1000 mL 10 mL 母液 3（100 倍）KH2PO4 17.0 g 1000 mL 10 mL Na2-EDTA 3.730 g 母液 4（100 倍）FeSO47H2O 2.780 g 1000 mL 10 mL H3BO3 0.31 g MnSO44H2O 1.115 g ZnSO47H2O 0.43 g KI 0.0415 g NaMoO42H2O 0.0125 g CuSO45H2O 0.00125 g 母液5（50 倍）CoCl26H2O 0.00125 g 1000 mL 20 mL 肌醇（Inositol）20.0 g 甘氨酸（Gly）0.4 g 烟酸（VB3）0.100 g 盐酸吡哆醇（VB6）0.100 g 母液 6（200 倍）烟酸硫胺素（VB1）0.020 g 1000 mL 5 mL DB36/T 13062020 6 B B 附 录 B（规范性附录）植物生长调节物质母液配制 B.1.1 称量：用分析天平或电子天平准确称取生长素（或细胞分裂素）50mg100mg。B.1.2 溶解：生长素（如IAA、IBA、NAA、2,4-D）可用适量0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，细胞分裂素（如KT、ZT、6-BA）可用0.1 mol/L的HCl加热溶解。B.1.3 定容：加蒸馏水定容至100mL，配制成浓度为0.5mg/mL1mg/mL的溶液。DB36/T 13062020 7 C C 附 录 C（规范性附录）MS培养基配制 1 L MS基本培养基配制：根据培养基成分准备好蒸馏水、琼脂、蔗糖和各类母液等。加蒸馏水700mL（按所需容量的70%左右），再加入琼脂7g，加热并不断搅拌使琼脂完全融化。加入蔗糖30g，待完全溶解后，按附录A加入母液，再根据要求加入适量植物生长调节物质并充分搅拌，最后定容至1L。用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调节pH值至5.8。_