ICS 65.120 B 25 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 946 2020 饲料中氨 基酸的测 定 离子交 换色谱 法 Determination of amino acids in feeds-Ion exchange chromatography 2020-06-29 发布 2020-08-01 实施 天 津 市 市 场 监 督 管 理 委 员 会 发布 DB12/T 946 2020 I 前 言 本标准 依据GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由天 津市 农业 农村 委员会 提出 并归 口。本标准 起草 单位：天 津市 畜牧兽 医研 究所。本标准 主要 起草 人：杨鸿 雁、梁 世岳、李 玉鹏、陈 龙宾、范寰、乔 家运。DB12/T 946 2020 1 饲 料中氨 基酸的测 定 离子交 换色谱 法 1 范围 本标准 规定 了饲 料中 氨基 酸的离 子交 换色 谱法 测定 方法的 原理、试剂 和材 料、仪器设 备、样 品的 采集与制 备、测定 步骤 和结 果计算。本标准 适用 于饲 料原 料、配合饲 料及 浓缩 饲料 中氨 基酸含 量的 测定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的引 用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 603 化学 试剂 试 验 方法中 所用 制剂 及制 品的 制备 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动 物饲 料 试 样的制 备 3 原理 3.1 常规酸 水解 法 饲料中 的蛋 白质 在盐 酸的 作用下，水 解成 单一 氨基 酸，经 离子 交换 色谱 法分 离并以 茚三 酮柱 后 衍 生测定。水解 中，色氨 酸全 部被破 坏，不能 测量，胱 氨酸和 蛋氨 酸部 分氧 化，不能测 准。3.2 氧化酸 解法 将饲料蛋 白 中的 含硫 氨基 酸（胱 氨酸 和蛋 氨酸）用 过甲酸 氧化，使 之转 变为 对酸稳 定的 氧化 物，再通过酸 水解 法释 放出 来，经离子 交换 色谱 法分 离并 以茚三 酮柱 后衍 生测 定。3.3 碱水解 法 饲料中 的蛋 白质 在碱 的作 用下，水解 出色 氨酸，经 离子交 换色 谱法 分离 并以 茚三酮 柱后 衍 生 测 定。4 试剂和 材料 4.1 本标准 所用 试剂 和水，在 没有注 明其 它要 求时，均 指分析 纯试 剂 和GB/T 6682 中规 定的 一级 水；所述溶 液如 未指 明溶 剂均 系水溶 液。试 验中 所需 溶液、制剂及 制品，在没 有注 明 其它要 求时 均 按 GB/T 603的规定 制备。4.2 盐酸：优级 纯。4.3 盐酸溶 液（6 mol/L）：量 取盐 酸500 mL，用 水稀 释 至 1000 mL，混 匀。4.4 茚三酮 溶液：按 仪器 说明 书配制 或购 买。4.5 pH 系 列缓 冲液、再 生液：按仪器 说明 书配 制或 购买。DB12/T 946 2020 2 4.6 甲酸：浓度 为88%。4.7 过甲酸 溶液：将30%过氧 化氢与 甲酸 按体 积 比 1:9 混合，室温 放 置1 h，置 冰 水浴中 冷 却 30 min,临用前 配制。4.8 盐酸溶 液（7.2 mol/L）：取盐 酸600 mL，用 水稀 释 至 1000 mL，混 匀。4.9 氢氧化 锂溶 液（4 mol/L）：称取 一水 合氢 氧化 锂 167.8 g，用 水溶 解并 稀释 至 1000 mL，混 匀。4.10 柠檬酸 钠缓 冲液：称 取柠 檬酸三 钠 14.71 g、氯 化钠 2.92 g 和柠 檬酸10.50 g，溶 于500 mL 水中，加入 硫 二甘 醇5 mL 和 辛酸0.1 mL，定容 至1000 mL。4.11 氢溴酸（48%）：分 析纯。4.12 高纯氮 气：纯度 为 99.999%。4.13 氨基酸 混合 标准 储备 液：含 L-天门 冬氨 酸、L-苏 氨 酸等17 种 常规 水解 分析 用 氨基酸，各组分 浓度均 为2.50 mol/mL。4.14 磺基丙 氨酸-蛋 氨酸 砜标 准 储 备液：准确 称取 磺基 丙氨 酸（纯 度 99.0%）105.7 mg 和 蛋氨 酸砜（纯度 99.0%）113.3 mg，用水 溶解 并定 容 至250 mL,浓 度均 为2.50 mol/mL，2 8 保 存，有效期1 年。4.15 色氨酸 标准 储备 液：准确 称取色 氨酸 标准 品（色谱 纯）127.5 mg，加少 许水 和数 滴 0.1 mol/L氢氧化 钠溶液 使 之溶 解，用水定 容 至 250 ml，浓度为 2.50 mol/mL，2 8 保存，有效期 1 年。4.16 混合氨 基酸 标准 工作 液：准确吸 取 氨 基酸 混合 标准 储备液、磺 基丙 氨酸-蛋 氨 酸砜标 准储 备液和色氨酸 标准 储备 液 各1 mL，置 于25 mL 容 量瓶，用 柠檬酸 钠缓 冲液 定容，混 匀，各 氨基 酸组 分浓 度 均为100 nmol/mL，2 8 保存，有效期 3 个 月。5 仪器设 备 5.1 样品粉 碎机。5.2 样品筛 孔 径0.18 mm。5.3 分析天 平 感量0.1 mg。5.4 恒温鼓 风干 燥 箱。5.5 氮吹仪。5.6 旋涡混 合仪。5.7 氨基酸 分析 仪 具有 离子 交 换柱、茚三 酮柱 后衍 生装 置及 570 nm 和440 nm 光 度检测 器。6 样品的 采集 与制 备 按GB/T 14699.1 采 集样 品；按GB/T 20195 制 备样 品，要求 样品 粉碎 至过0.18 mm 孔 径（80 目）样 品筛，充 分混 合均 匀后 装入 密封袋 中备 用。7 测定步 骤 7.1 样品的 水解 7.1.1 常规酸 水解 法 称取试样30 mg 70 mg（约含蛋 白质5 mg 20 mg，精确至0.1 mg）于25 mL 水 解管中，准 确加 入10 mL盐 酸溶液，充氮气约1 min 后 拧紧瓶盖，将水解管放入1101 恒温干 燥箱，水解22 h 24 h。冷却至室 温，混匀。DB12/T 946 2020 3 7.1.2 氧化酸 解法 称取试样50 mg 100 mg（约含蛋 白质7.5 mg 25 mg，精确 至0.1 mg）于25 mL 水解管 中，冰 水浴冷却30 min 后，加 入已 冷却 的过甲 酸溶 液2 mL，待 样品 湿润（勿 摇），拧紧 瓶盖，连同冰 浴一 起置 于0 4冰 箱中，反 应16 h，加入0.3 mL 氢 溴酸，振 摇后 放回冰 浴静 置30 min，取出 放至 室 温 后，加入10 mL盐酸溶 液，充氮气 约1 min 后拧 紧瓶盖，将水 解管放入1101 恒温干燥 箱，水 解22 h 24 h。冷却至室温，用 水将 内容 物转 移到25 mL 容量 瓶，定容，混匀。7.1.3 碱水解 法 称取试样50 mg 100 mg（约含蛋 白质7.5 mg 25 mg，精确 至0.1 mg）于10 mL 聚四氟 乙烯水 解管中，加 入1.5 mL 氢氧 化锂 溶液，充氮 气约1 min 后 拧 紧瓶盖，放 入1101 恒温干 燥箱，水 解20 h后，冷却至 室温，用 水将 内容 物转移 到25 mL 容量 瓶中，用盐酸 溶液 中和 至pH 值 为67，定容，混匀。注：以上三种方法依所要测定的氨基酸种类选用。7.2 上机水 解液的 制备 将上述 水解 液过滤，取0.5 mL滤 液于小 试管 中，置 于氮吹 仪，65 吹 干，必 要时加 少许水 重复 蒸干2次3次。准 确加 入2 mL 5 mL 柠 檬酸 钠缓 冲液，旋涡混 合仪 混匀，用0.22 m水 系过 滤器 过滤 到上机瓶中，待 测。7.3 测定 按照仪 器使用说明书 放置茚三酮 溶液与pH 系列缓冲液、再 生液，设置仪 器色谱条件，将混合氨 基酸标准 工作 液与 处理 好的 样品水 解液 一同 上机 测定，仪器自 动将 试样 的各 氨基 酸色谱 峰面 积与 相应 的 标准品峰 面积 对比，计 算分 析，得 出各 氨基 酸的 含量，见图1。图1 混合氨 基酸 标准 工作 液 色 谱图 8 结果计 算 DB12/T 946 2020 4 8.1 计算方 法 氨基酸 含量 计算 见式（1）。W（%）=.(1)式中：W 某氨 基酸 的含 量，%；A 每毫 升上 机水 解液 氨 基酸的 含量，ng；D 稀释 倍数；M 试样 质量，mg。8.2 允许差 对于酸 解测 定的 氨基 酸，当含量 小于 或等 于0.5%时，两 平行 样测 定值 相对 偏 差不大 于5%；含量 大 于 0.5%时，相对 偏差 不大于4%。对于 色氨 酸，当 含量 小 于0.2%时，两 平行 样测定 值之差 不大于0.03%；含量大于 或等 于0.2%时，相 对偏差 不大 于5%。_