ICS 65.120 B 46 DB50 重 庆 市 地 方 标 准 DB50/T 9532019 饲料中大肠杆菌 O157的快速检测 环介导等温扩增（LAMP）法 Rapid determination of Escherichia coli O157 in feeds Loop-mediated isothermal amplification detection method 重庆市市场监督管理局 发 布 2019-12-12发布 2020-03-15实施 DB50/T 953-2019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由重庆市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：重庆市动物疫病预防控制中心，重庆市兽药饲料检测所。本标准主要起草人员：胡健、周莉、侯亚莉、朱英才、盛欣、丁平、何义刚、张毅、王美珍、张军等。DB50/T 953-2019 1 饲料中大肠杆菌O157 的快速检测方法 环介导等温扩增（LAMP）法 1 范围 本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）法检测饲料中大肠杆菌 O157 的原理、试剂、仪器和设备、操作步骤、结果判定和表述。本标准适用于饲料中大肠杆菌 O157的筛选检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.36 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌 O157:H7/NM 检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 生物安全措施 培养物和废弃物处理应按照GB 19489的规定执行。4 原理 用热裂解法提取大肠杆菌O157的基因组DNA作为环介导等温扩增模板，根据大肠杆菌O157的rfbE基因特异序列，设计5条LAMP引物(参见附录A），建立LAMP反应体系，恒温反应结束后根据添加的染料显色情况进行结果判断。5 试剂 5.1 除另有规定外，试剂为分析纯试剂，试验用水符合GB/T 6682的要求。5.2 改良 EC肉汤（mEC+n）。5.3 营养肉汤。5.4 生理盐水。5.5 双蒸水（ddH2O）。5.6 合成大肠杆菌 O157检测用引物，包括外引物一对，内引物一对，环状下游引物一条。外引物 F3：5-TCTCAATTCTAACTAGGACCGCAGA-3；外引物 B3：5-ATAACTTGCTCATTCGATAGGCTGG-3；内引物 FIP：5-ACAGGGTAAAAAACTGGCCTGAGGAATTAAGGAATCACCTTGC-3；内引物 BIP：5-CACGATGCCAATGTACTCGGAAAAATAATTCCACGCCAACCAAGA-3；环状下游引物 LB：5-ATCAAAAGCACCCTATAGCTGAG-3。将各引物用双蒸水溶解，配置成 100 mmol/L的储备浓度，用双蒸水稀释为 10 mmol/L工作浓度备用。5.7 Bst DNA 聚合酶。5.8 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPS），包括 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 10 mmol/L。5.9 MgCl2溶液（50 mmol/L）。5.10 10Bst DNA 聚合酶缓冲液（200 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)、100 mmol/L KCl、100 mmol/L(NH4)2SO4、20 mmol/L MgSO4、1%Triton X-100）。5.11 甜菜碱，用双蒸水溶解，配置成 5 mol/L溶液。DB50/T 953-2019 2 5.12 钙黄绿素 C46H46N2O23，用双蒸水溶解，配置成 625mol/L溶液。5.13 MnCl2，用双蒸水溶解，配置成 7.5 mmol/L溶液。5.14 阳性对照：大肠杆菌 O157 标准菌株基因组 DNA。6 仪器和设备 6.1 移液器，量程为 0.5L10L，10L100L，量程 100L1000L。6.2 无菌均质袋，500mL。6.3 锥形瓶，500mL。6.4 水浴锅或恒温金属浴，精度1。6.5 高速离心机，7000 g。6.6 恒温培养箱，精度1。6.7 电子天平：感量 0.01g、感量 0.0001g。7 采样 7.1 采样原则 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。7.2 采样方法 7.2.1 应在同一批次产品中采集样品，每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于500g（mL）。7.2.2 独立包装不大于 500g的固态产品或不大于 500mL的液态产品，取完整包装。7.2.3 独立包装大于 500mL的液态产品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均匀后采集适量样品，放入无菌采样容器内作为一个样品。7.2.4 独立包装大于 500g的固态产品，应用无菌采样器从同一包装的不同部分分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件样品。7.3 采集样品的贮存和运输 7.3.1 应尽快将样品送往实验室检验。7.3.2 应在运输过程中保持样品完整。7.3.3 应在接近原有贮存温度条件下贮存样品，或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。8 操作步骤 8.1 样品制备、增菌培养 称取25 g样品（精确至0.01g），加入装有225 mL改良EC肉汤的500 mL锥形瓶或无菌均质袋内，混匀后在361恒温培养箱内培养18 h24 h。8.2 大肠杆菌 O157模板 DNA的提取 取1 mL8.1得到的增菌液，7000 g离心1 min，弃掉上清液；加入500 mL ddH2O悬浮沉淀，7000 g离心1 min，弃掉上清液，重复一次；用100L ddH2O悬浮沉淀后放置于100水浴锅中煮沸10 min，7000 g离心1 min，取上清液，-20 保存3个月备用。DNA提取也可用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照其说明提取制备大肠杆菌O157基因组DNA。DB50/T 953-2019 3 8.3 环介导等温扩增 8.3.1 反应体系 在200L的PCR反应管中依次加入10Bst DNA聚合酶缓冲液2.5L、dNTPs 1.5L、MgCl2 1.25L、引物溶液（外引物、内引物、环引物分别加入0.25L、2L、1L）、模板DNA 2L、Bst DNA聚合酶1L、甜菜碱4L、MnCl2 1L、钙黄绿素1L，加入ddH2O补足25L。8.3.2 反应过程 在63（1）水浴锅或金属浴中放置50 min。8.4 空白对照、阴性对照、阳性对照设置 试样检测过程应同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。阴性对照为经确证无大肠杆菌O157的饲料，按8.18.3步骤操作；空白对照设为以水替代DNA模板，按照8.3步骤操作；阳性对照为大肠杆菌O157标准菌株接种于营养肉汤在361培养18 h24 h后，用无菌生理盐水稀释至约106 CFU/mL至108 CFU/mL（约麦氏浊度0.4），按8.2提取基因组DNA作为模板，按8.3步骤操作。8.5 结果观察 反应结束后，将反应管取出观察显色情况（不开盖）。9 结果判定和表述 9.1.1 在空白对照管和阴性对照管反应液呈橙色，阳性对照管反应液呈绿色的情况下，检测条件成立，反之本次实验无效。9.1.2 样品反应管中液体呈橙色，可报告 25 g饲料中未检出大肠杆菌 O157；样品反应管中液体呈绿色，说明 25 g饲料中大肠杆菌 O157初步筛选为阳性，需要对样品增菌液进一步按 GB 4789.36 中操作步骤进行确认后报告结果。DB50/T 953-2019 4 附录A(资料性附录)大肠杆菌0157靶基因序列 A.1 大肠杆菌 O157靶基因序列（accession no AF16332.1）TCTCAATTCT AACTAGGACC GCAGAGGAAA GAGAGGAATT AAGGAATCAC CTTGCAGATA AACTCATCGA AACAAGGCCA GTTTTTTACC CTGTCCACAC GATGCCAATG TACTCGGAAA AATATCAAAA GCACCCTATA GCTGAGGATC TTGGTTGGCG TGGAATTAAT TTACCTAGTT TCCCCAGCCT ATCGAATGAG CAAGTTAT _