ICS 13.060.30 Z 10 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 3764-2020 医疗污水 病毒检测 样品制备 通用技术 规范 General technical specification for the sample preparation of viral test in medical wastewater 2020-03-11 发布 2020-03-12 实施 发布 DB32/T 3764-2020 I 目 次 前言.1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 术语、定 义和 缩略 语.1 4 试剂 和材 料.2 5 仪器 与设 备.3 6 样品 采集、保 存、运输 和交接.3 6.1 样 品采 集.3 6.2 样品 保 存、运输 和 交接.4 7 样品 制备.4 7.1 总则.4 7.2 技 术要 求.4 7.3 pH 调节.5 7.4 预 过滤 与悬 浮颗 粒 物病毒 检测 样品 制备.5 7.5 游 离态 病毒 检测 样 品制备.5 7.6 数 据记 录.5 8 质量 控制.5 9 废物 处置.5 10 风 险防 范.6 10.1 现 场采 集.6 10.2 样 品运 输.6 10.3 实 验室 分析.6 附录 A（资料 性附 录）医疗污 水病 毒检 测样 品采 集和制 备记 录表.7 附录 B（规范 性附 录）医疗污 水病 毒检 测样 品制 备过程 中质 量控 制方 法.8 参考文 献.10 DB32/T 3764-2020 II 前 言 为指导 全省 医疗 机构 开展 医疗污 水中 病毒 的监 测，规范医 疗污 水 病 毒检 测 样 品制备 流程，确 保监 测数据准 确，根据 医 疗机 构水污 染物 排放 标准 污水监 测技 术规 范 等有 关规定，特 制定 本标 准。本标准 由 南 京大 学 提 出。本标准 由 江 苏省 生态 环境 厅 归口。本标准 起草 单位：南 京大 学宜兴 环保 研究 院、南京 大学、清华 苏州 环境 创新 研究院。本标准 主要 起草 人：任洪 强、张 徐祥、耿 金菊、刘鹏、黄霞、刘欣 宇、许柯、朱燕、周 小红、刘艳臣、吴兵、黄辉。DB32/T 3764-2020 1 医 疗污水 病毒检测 样品制 备通用技 术规范 1 范围 本标准 规定 了医疗 污水 病 毒检测 样品 制备 的 试 剂和 材料、仪器 和设 备、样品 采集、保存、运输 和交接、样品 制备、质量 控制、废物 处置 和风 险防 范要 求。本标 准 适用 于医 疗污 水病 毒 检测 样品 制备。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB 18466-2005 医疗 机构 水污染 物排 放标 准 HJ 91.1-2019 污水 监测 技 术规范 HJ 421-2008 医 疗废 物专 用包装 袋、容器 和警 示标 志标准 医疗废 物集 中处 置技 术规 范（试 行）环发 2003 206 号 3 术语、定义 和缩 略语 3.1 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1.1 医疗污水 medical wastewater 从事疾 病诊 断、治疗 活动 的医院、卫 生院、疗养 院、门诊 部、诊 所、卫 生急 救站等 产生 的废 水，主要指医 疗机 构门 诊、病房、手术 室、各 类检 验室、病理解 剖室、放 射室、洗 衣房、太平 间等 处排 出的 诊疗废水、生 活及 粪便 污水。当医 疗机 构其 他污 水与 上述污 水混 合排 出时，视 为医疗 污水。3.1.2 病毒 virus 由 核酸 和蛋 白质 外壳 构成 的严格 细胞 内寄 生的 非细 胞生物。3.1.3 样品制备 sample preparation 根据检 测方 法的 要求，将 样品处 理到 符合 后续 分析 要求的 所有 样品 制备 过程，包括 但不 限于 pH 调节、预 过滤 和样品 富 集等 步骤。DB32/T 3764-2020 2 3.1.4 病毒富 集 viral enrichment 通过吸 附-洗脱、离心-重悬浮、过滤 等技 术方 法，缩小 样 品体 积同 时提 高样 品中 病 毒浓 度的 过程。3.1.5 空白样 品 blank sample 将实验 用水 代替 实际 样品，按照 与实 际样 品一 致的 分析步 骤进 行测 定。3.1.6 空白加 标样 品 blank spike sample 将实验 用水 代替 实际 样品，并添 加已 知量 标准 物质，按照 与实 际样 品一 致的 分析步 骤进 行测 定。3.1.7 基体加 标样 品 matrix spike sample 在待测 样品 中添 加已 知量 标准物 质的 样品，按 照与 实际样 品一 致的 分析 步骤 进行测 定。3.1.8 噬菌体 效价 bacteriophage titer 每毫升 试样 中含 有侵 染性 噬菌体 的粒 子数，一 般以 噬菌斑 形成 单位（Plaque forming unit,PFU）计数。3.2 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。EDTA：乙二 胺四 乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid）Tris：三 羟甲 基氨基 甲烷（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol）4 试剂和 材料 4.1 所用试 剂 应 使用 分析 纯试 剂和无 菌纯 水，特殊 情况 除外。4.2 浓盐酸 溶液：（HCl）=37%。4.3 浓硫酸 溶液：c（H2SO4）=18.4 mol/L。4.4 乙醇溶液：（C2H5OH）=75%。4.5 消毒 剂：有 效氯 浓度 为 1000 mg/L。4.6 次氯酸 钠溶 液：有 效氯 质量分 数 为 5%。4.7 次氯酸 钠溶 液：有 效氯 质量分 数 为 0.1%。取 20 mL 次氯酸钠溶 液（4.6），与 980 mL 无菌纯水混 合。DB32/T 3764-2020 3 4.8 硫代硫 酸钠 溶液：（Na2S2O3）=5%。称取 预 先在 105 110 干燥 2 h 的硫 代硫酸 钠 50 g，溶于 950 mL 纯水中，在 20 2 下 平衡，混 匀。放入聚 乙烯 瓶或 硬质 玻璃 瓶中，密封 保存。4.9 盐酸溶 液：c（HCl）=1 mol/L。量取 83 mL 浓 盐酸溶液（4.2），缓 慢加 入 917 mL 水 中，混 匀。4.10 氯化镁 溶液：c（MgCl2）=2.5 mol/L。称取预先 在 105 110 干燥 2 h 的 无水 氯化镁 23.80 g，溶解 于 80 mL 水中，加水 稀释 至 100 mL，混匀。4.11 稀硫酸 溶液：c（H2SO4）=100 mmol/L。使用玻璃 棒沿杯 壁 向 纯水 中缓 慢加 入 5.4 mL 浓硫酸溶液（4.3），充 分混 匀。待 冷却至 室温 后，加水 稀释 至 1000 mL，放入聚 乙烯 瓶或硬 质玻 璃瓶 中，密封保存。4.12 稀硫酸 溶液：c（H2SO4）=0.5 mmol/L。向纯水中 加入 5 mL 的稀硫酸 溶液（4.11），充分 混匀。待 冷却 至室 温后，加 水稀释 至 1000 mL，放入聚乙烯 瓶或 硬质 玻璃 瓶中，密封 保存。4.13 氢氧化 钠溶液：c（NaOH）=1 mol/L。称取 4 g 氢 氧化钠 溶解 于 纯 水中，混匀，待冷 却 至 室温后，加 水稀 释 至 100 mL，放入聚 乙烯 瓶中，密 封保 存。4.14 氢氧化 钠溶液：c（NaOH）=1 mmol/L。向纯水中 加入 1 mL 氢氧化钠 溶液（4.13）充 分混 匀,加水稀 释 至 1000 mL，并放入聚 乙烯 瓶中，密 封保 存。4.15 100 Tris-EDTA 缓冲 液：称 取 12.11 g 三 羟甲 基氨 基甲 烷，3.36 g 乙二 胺四 乙酸 二 钠，溶 解 于 80 mL纯水中，使 用盐 酸溶 液（4.9）调节 pH 值 至 8.0，加 水稀释 至 100 mL。放入聚 乙烯瓶 中，密封 保存。4.16 磷酸盐 缓冲 液：称 取磷 酸二 氢钠 0.58 g，磷酸 氢二 钠 2.5 g，氯化 钠 8.5 g，溶 解于 850 mL 纯水中，定容 至 1000 mL。转移至 硬质玻 璃瓶 中 于 121 灭菌 15 min，于 4 保存，不超 过 1 个 月。4.17 玻璃纤 维 滤 膜：直 径 90 mm，孔径 0.45 m。4.18 混合纤 维素 酯滤 膜：表面 负电滤 膜，直径 90 mm，孔径 0.45 m。4.19 超滤离 心管：容积 15 mL，配有 100 kDa 滤 膜。4.20 离心管：材 质为 聚丙 烯，容积 15 mL。4.21 冻存管：容积 2 mL。5 仪器 和 设备 5.1 水质取 样器：容积 不小于 2500 mL，材质为有 机玻 璃。5.2 真空泵：最高 压力 大于 等 于 4 bar，最 高真 空度 大于 等于-80 KPa，最高 空载 流 量大于 等 于 20 L/min。5.3 砂芯过 滤器：滤 头直 径 为 90 mm，接收瓶 体积 为 1000 mL，并配备漏 斗。5.4 高速冷 冻离 心机：离心 温度 可在 4 20 范围 内 调节，转 速可 在 010000 g 范围 内调 节，配备50 mL 规格离心 管。5.5 超低温 冰箱：最 低保 存温 度为-80。5.6 冰箱：温控 范围 能够 保证 达到 2 8。5.7 pH 计：测量 范围 014，最小分 度 为 0.1 pH 单位。6 样品采 集、保存、运输 和 交接 6.1 样品采 集 6.1.1 应按 照 HJ 91.1-2019 中 5.1 和 GB 18466-2005 中 6.1.1 的规定 设置 单位 污水 排放 口，并设 置排 放口标志。6.1.2 采样前 应了 解医疗 污 水来 源及性 质、排放 规律、医 疗污水 处理 工艺、污 水类 型和污 水排 放标 准等情况。DB32/T 3764-2020 4 6.1.3 在单位 污水 排放 口设 置监 测点位，应 按照 GB 18466-2005 中 6.1.2 的 规定。当监 测污水 处理 设施对病毒 的 整 体处 理效 率时，应 在污 水进 入污 水处 理设 施的进 水口 和 污 水处 理设 施的 出 水口 设置 监测 点位；当 监测 各污 水处 理单 元 对 病毒 的 处理 效率 时，在各 污 水进入 污水 处理 单元 的进 水口和 污水 处理 单元 的 出水口设 置监 测点 位。6.1.4 单位污 水排 放口 的监 测点 位，监 测频 率每 月 不 应少 于一次；污 水处 理设 施的 进水口 和污 水处 理设施的 出水 口的 监测 点位，监测 频率 每季 度不 应少 于一次；污 水处 理 单 元的 进水口 和 污 水处 理单元的出水口 的 监测 点位，监 测频 率 每季 度不 应该 少于 一次。6.1.5 采样频 率为 每 4 h 采 样一 次，一 日至 少采 样 3 次，测定结 果以 日均 值计。6.1.6 收治了 传染 病病 人的 医疗 机构，应 根据 GB 18466-2005 中 6.1.3 的规 定增 加采 样频率。单 位污 水排放口 的监 测点 位，应 每 日监测；污水 处理 设施 的 进水口 和 污 水处 理设 施的 出水口 的监 测点 位，每 周 不应 少于 一次；污 水处 理 单 元的进 水口 和 污 水处 理 单 元的 出 水口 的监 测点位，每周 不 应少 于一 次。6.1.7 采样容 器采 用聚 乙烯 塑料 桶，使 用前 应用 次氯 酸钠 溶液（4.7）浸泡 30 min，并使 用无 菌水 冲洗 3 次。6.1.8 采样前，水 质取 样器 应用 次氯酸 钠溶 液（4.7）浸泡 30 min，并 使用 无菌 水 冲洗 3 次。6.1.9 采样前，水 质取 样器 和采 样容器 应使 用待 采样 品冲 洗 3 次。6.1.10 样品采 集体 积应 不少 于 5 L，保存 于聚 乙烯 塑料 桶中。6.1.11 若样品 为经 过有效 氯 消毒 的污水，应 在采 样后 立即 用硫代 硫酸 钠溶 液（4.8）充分中 和游离 余氯。可 考虑 每升 水样 添 加 10 mL 硫代硫酸 钠溶 液（4.8），混匀。6.1.12 样品容 器上 应粘 贴标 识或 标签，采集 时记 录样 品信 息，注 明编 号、采样 日期、采样地 点和 采样者姓名 等信 息。6.2 样品保 存、运输 和交 接 6.2.1 样品保 存、运输 和交接 应 符合 HJ 91.1-2019 中第 7 章的规 定。6.2.2 采样后，样 品应 立即 冷藏 避光保 存，冷藏 温度 宜 为 2 8。样 品采 集结 束 后应密 封保 存，并使 用 75%乙醇 擦拭 消毒 或有效 氯 1000 mg/L 的消毒 剂 对 外包 装擦 拭 消 毒后，再 进 行二 次密 封后 装运回实验 室。6.2.3 运输过 程中 应防 止样 品容 器霜冻、破 裂、温度 升高 或外部 污染。6.2.4 样品的 制备 应在 24 h 内 完 成。若 因实 验条 件限 制无 法及时 完成，应 将水 样于-20 保存，不 超过 1 周，且 应避 免反 复冻 融。7 样品制备 7.1 总则 7.1.1 医疗污 水病 毒检 测样 品包 括吸附 于污 水中 悬浮 颗粒 物表面 的病 毒检测 样品 和 污水中 游离 态病毒检测 样 品。7.1.2 样品制 备应 尽量 于采 样现 场完成。若 现场 不满 足制 备要求，应 按 照 6.2 的规 定转移 至实 验室 进行处理。7.1.3 根据病 毒检 测的 具体 要求，样品 制备 可选 择但 不限 于下列 过程，包 括样 品 的 pH 调节、预 过滤和病毒 富集 等步 骤。7.2 技术要 求 7.2.1 用于分 样和 装样 的器 具均 应灭菌 处理。7.2.2 离心管、冻 存管 等耗 材均 应采用 市售 经环 氧乙 烷灭 菌产品。DB32/T 3764-2020 5 7.2.3 过滤装 置 中 耐高 温器 材宜 使用压 力蒸 汽灭 菌；不耐 高温器 材宜 使用 次氯 酸钠 溶液（4.7）浸泡30 min，并使用 无菌 水冲 洗 3 次。7.3 pH 调节 根据水 样 pH 值，使用 盐酸 溶液（4.9）或氢 氧化 钠 溶液（4.13）将水 样 pH 调节 至 7.07.5。7.4 预过滤 与悬 浮颗 粒物 病毒 检测 样 品制 备 7.4.1 组装玻 璃纤 维 滤 膜过 滤装 置。7.4.2 取 7.3 得到 的 2 L 水样进 行 预过滤，以 去除水 样中 悬 浮颗粒 物，过滤后 滤液 转 移至 2 L 玻璃 烧杯中。若 水样 中悬 浮颗粒 物 含量较 高，出现 滤膜 堵塞，过滤 流速 缓慢 的情 形，应 适时 更换 滤膜。7.4.3 将 7.4.2 得 到的 含有 悬浮 颗 粒物 病 毒检 测样 品 的 玻璃 纤维 滤 膜放 入无 菌离 心管 中，于-80 保存，应于 6 个月 内完 成后 续实 验分析。7.5 游离态 病毒 检测 样品 制备 7.5.1 向 7.4.2 得 到的 滤液 中加 入 20 mL 氯化镁溶液（4.10），充分 搅拌 均匀。7.5.2 组装混 合纤 维素 酯滤 膜 过 滤装置。7.5.3 对 7.5.1 得 到的 水样 进行 过 滤，以 吸附 水样 中的 游离 态 病毒，弃 去滤 液。7.5.4 向漏斗 中加 入 200 mL 稀硫酸溶液（4.12）对 滤膜 进行冲 洗，弃去 冲洗 液。7.5.5 使用 10 mL 氢氧化钠 溶液（4.14）对 滤膜 表面 的 游 离态 病 毒颗 粒进 行洗 脱，洗脱液 收集 于 15 mL 无菌离心管 中。7.5.6 向洗脱 液中 加 入 50 L 稀硫酸溶液（4.11）和 100 L 100 Tris-EDTA 缓 冲液（4.15）中和 氢氧化钠 溶液，得 到 游 离态 病毒浓 缩液。7.5.7 将 7.5.6 得 到的 游离 态病 毒 浓缩液 转移 至超 滤离 心管 中，可 根据 超滤 离心 管使 用说明，选 择合 适离心力 和离 心时 间，得到 体积约 为 600 L 游离态 病 毒浓缩液 样品，弃去 下层 滤液。7.5.8 将 7.5.7 得到 的 游离 态病 毒 浓缩液 样品 转移 至冻 存管 中，于-80 保 存，应于 6 个月内 完成 后续实验分 析。7.6 数据记 录 将采样 时间、地 点、工 艺 类型、采样 位点、浓缩 前 体积、浓缩 液体 积、空 白 加标回 收率、基体 加标回收率、保 存方 式等 参数 记录于 医疗 污水 中病 毒样 品采集 和制备 记 录表 中，记录表 样式 参 照 表 A.1。8 质量控 制 8.1 实验过 程应 按照 附 录 B 规 定的方 法，选择 噬菌 体 MS2 作为 标准 物质，使 用双 层平板 法测 定样 品制备前 后噬 菌 体 MS2 的效 价，并 计算 样品 制备 过程 中噬菌 体 MS2 的 回收 率。8.2 实验过 程应 严格 设置 空白 样品、空白 加标 样品 和 基 体加标 样品。8.3 每批样 品应 设置 一个 空白 样品实 验。空白 样品 实验 中 病毒 不得 检出。8.4 每批样 品应 设置 一个 空白 加标样 品实 验。空白 加标 样品实 验回 收率 应不低于 50%。8.5 每批样 品中 设置 基体 加标 样品 数 量不 低于 总样 品 的 10%，若样 品数 量不 足 10 个，应 至少 设置 一个 基体 加标 样品 实验。基 体加标 样品 实验 回收 率应 不低 于 10%。9 废物处 置 DB32/T 3764-2020 6 9.1 样品采 集和 实验 过程 中产 生的所 有固 体、液体 废弃 物 的处置 应按 照 医疗 废物 集 中处置 技术 规范 的规定 进行。9.2 医疗废 物专 用包 装袋、容 器和警 示标 志应符合 HJ 421-2008 中第 7 章 规定。10 风险防 范 10.1 现场采 集 10.1.1 采 样过程 采样人 员在 样品 采集 全过 程，应佩 戴医 用外 科口 罩、一次性 橡胶 手套、一次 性工 作帽和 一次 性鞋 套。疫情期间采 样 应佩戴 符合N95/KN95 及以 上标准的 医用 防护口罩，还应加穿 双层 一次性乳 胶手套、一次性防护 服、全 面型 呼吸 防 护器或 正压 式头 套（若 条 件有限，可佩 戴封 闭式 护 目镜等）；口 罩脏 污、变形、损坏、有异 味 或 连续 佩戴4 小 时应 及时 更换。10.1.2 采 样结 束 采样结 束后，防 护要 求如 下：应喷洒 75%乙醇 对仪 器设 备进行 擦拭 消毒，仪器 设 备在返 回单 位入 库前 应再 次用 75%乙醇 进行二次 消毒；采样人 员应 立即 用 有 消毒 功能的 洗手 液或 肥皂 和流 水洗手，返 回住 所后 应及 时全面 清洁；采样人 员应 使用 含氯 消毒 液、75%乙醇 或 消毒 湿巾 对个人 防护 用品 进行 消毒；疫情期 间采 样 人员 应 采 用生 物 安 全三 级 防护 要 求 顺序 脱 防 护服 并 立即 使 用含消 毒 功 能的 洗 手液或肥 皂和 流水 洗手，同 时使用 含氯 消毒 液、75%乙醇或 消毒 湿巾 对个 人防 护用品 进行 消 毒。10.2 样品运 输 10.2.1 运送人 员在 运送 过程 中 应 穿戴防 护手 套、医用 防护 口罩、工作 服、靴等 防护 用品。10.2.2 感染性 样品 在运 送过 程中 发生意 外情 况导 致样 品溢 出、散 落等 情况 时，应立 即 向本单 位应 急事故小组 取得 联系，并 在受 污染地 设立 隔离 标识，其 它车辆 和行 人不得 穿 过。10.3 实验室 分析 10.3.1 实验室 应符 合二 级生 物安 全防护 要求。10.3.2 实验室 工作 人员 应合 理安 排仪器 使用 和实 验进 行的 时间，避免 室内 人员 过于 密集、多人 同时 进行实验（条 件允 许情 况下，可打 开排 风设 备保 持室 内空气 清新）。10.3.3 实验前 对实 验室 工具、仪 器、实 验台 表面 进行 紫外 消毒 30 min，实验 后 先 用 75%乙 醇或 含醇消毒湿 巾等 消毒 工具 擦拭 消毒，再进 行紫 外消 毒 30 min。处理、检 测疫 情期 样 品时应 在有 负压 的二 级生物安 全实 验室 中进 行实 验。10.3.4 实验室 工作 人员 进行 样品 交接时，应 佩戴 医用 外科 口罩、一次 性橡 胶手 套、一次性 工作 帽；疫情期间 接取 样品 时，交 接 双方宜 保 持 1.5 m 以上，并佩戴 一次 性橡 胶手 套、符合 N95/KN95 及以 上标 准的 医用 防护 口罩，还 应使 用 75%乙醇 对样 品外 包装 进行消 毒处 理。10.3.5 实验室 工作 人员 处理、测 试样品 时应 全程 佩戴 一次 性工作 帽、全面 型呼 吸防 护器或 正压 式头 套（若条 件有 限，可佩 戴封 闭性护 目镜）、医用 防护 口罩、防护 服、一次 性乳 胶手套、一 次性 鞋套。10.3.6 实验室 工作 人员 进行 样品 检测时，应 及时 更换 被样 品污染 的手 套。10.3.7 实验工作 人 员应 使用 单独 的清洗 池清 洁，避免 与其 它非实 验人 员共 用清 洗池。DB32/T 3764-2020 7 附 录 A（资料 性附 录）医疗污 水病 毒检测 样 品采 集和制备 记录 表 A.1 表A.1 给 出了 医疗 污水 病 毒 检测 样品 采集 和制备 记 录表格 式。表A.1 医疗污 水病 毒检测 样 品采 集和制备 记 录表 第 页 共 页 时间：地点：医疗机 构名 称：医院污 水处 理站 联系 人、联系方 式：工艺类 型：样品编 号：采样位 点：浓缩前 体积：浓缩液 体积：空白加 标回 收率：基体 加 标回 收率：保存方 式：采样人：样品制 备人：记录人：校对人：备注：DB32/T 3764-2020 8 附 录 B（规范 性 附 录）医疗污 水 病 毒检 测样 品制 备 过程 中质 量控 制方 法 B.1 试剂和 材料 B.1.1 所用试 剂应 使用 分析 纯试 剂和无 菌纯 水。B.1.2 磷酸盐 缓冲 液：参考4.16。B.1.3 噬菌体MS2 贮存 液：ATCC 15597-B1。效 价不 低于1010 PFU/mL 的噬菌体MS2 贮 存液。根据 本附录B.4 方法 测定 其实 际效 价。B.1.4 噬菌体MS2 工 作 液：根 据 噬 菌 体MS2 贮存 液 实 际 效 价，使 用 无 菌 磷 酸 盐 缓 冲 液 稀 释 至105 PFU/mL。B.1.5 宿主细 菌E.coli：ATCC 15597。噬菌 体MS2 宿主 细菌，OD600应 介于0.2 和0.4 之 间。B.1.6 固体培 养基 平板 制备：固 体培养 基A 组 分经121 灭菌15 min 后，降温 至45 50，加入50 mL培养基B 组分，充 分混 匀后，逐个 倾倒 入直 径为150 mm 的平板。凝 固后 置于4 保存，不超 过1 周。注1：固体培养 基 A 组分：称取胰蛋 白胨 10 g，氯化钠 8 g，酵母提取物 1 g，琼脂 15 g，加入 950 mL 纯水；培养基B 组分：称取葡萄糖10 g，氯化钙2.94 g，维生素B 100 mg，加入500 mL 纯水。完全溶 解后，采用孔径为0.22 m 的针式过滤器过滤除菌，除菌后于4 保存，不超过1 周。B.1.7 半固体 培养 基制 备：半固 体培养 基A 组 分经121 灭菌15 min 后，置 于4 保 存，不超 过1 周。注2：半固体培养 基 A 组分：称取胰 蛋白胨 10 g，氯化钠 8 g，酵母提取物 1 g，琼脂 5 g，加入 950 mL 纯水。B.1.8 一次性 针式 过滤 器：直径25 mm，孔径0.22 m。B.2 仪器和 设备 B.2.1 生化培 养箱：培 养温 度可 在0 60 范围 内调 节。B.2.2 恒温水 浴锅：温 度可 在室温 至99 范围 内调 节。B.2.3 电子万 用炉：功 率为1000 W。B.2.4 生物安 全柜：安 全等 级II。B.2.5 压力蒸 汽灭 菌器：灭 菌温 度可升 至121，压 力可 维持0.1 MPa0.15 MPa。B.3 质量控 制样 品的 设置 B.3.1 实验中 应设 置空 白样 品、空白加 标样 品和 基体 加标 样品。B.3.2 每批样 品应 设置 一个 空白 样品实 验。采用2 L 无菌磷 酸盐缓 冲溶 液作 为空 白样 品。B.3.3 每批样 品应 设置 一个 空白 加标样 品实 验。采用2 L 无菌磷酸 盐缓 冲溶 液添 加1 mL 噬菌体MS2工作液（B.1.4）作 为空 白加 标 样品。B.3.4 每批样 品中 设置 基体 加标 样品 数 量不 低于 总样 品的10%，若 样品数 量不 足10 个，应至 少设 置一个 基体 加标 样品 实验。采 用2 L 医疗污水 样品 添加1 mL 噬菌体MS2 工 作液（B.1.4）作为 基体 加标 样品。B.4 噬菌体MS2 效价 的测 定 B.4.1 采用双 层平 板法 测定 噬菌 体MS2 效价。B.4.2 培养基 准备 DB32/T 3764-2020 9 B.4.2.1 使用电 炉加 热半 固体 培养 基A 组分 至融 化，降 温至45 50，与培 养基B组 分按照950：50的比例 混合 得到 半固 体培 养基。将混 合后 的半 固体 培养基 按需 分装 至无 菌离 心管中，每 管中 加入35 mL半固体 培养 基。分装 后半 固体培 养基 放入45 水 浴 锅中保 持温 度，防止 凝固。B.4.2.2 取固体 培养 基平 板，将样 品名称、实 验时 间和 实验 人标记 于平 板背 面，倒置于37 生 化培 养箱预热30 min。B.4.3 待测样品量的选择。待测样品应进行梯度稀释，按 照1:10，1:100 和1:1000 进行稀释，用于后 续测试。B.4.4 向分装 有半 固体 培养 基的 离心管 中加 入梯 度稀 释后 待测样 品量5 mL，宿主细 菌E.coli 2.5 mL，离心管 上下 颠倒 混匀，避 免产生 气泡。B.4.5 将混有 样品 和宿 主细 菌E.coli 的半固 体培 养基 分别 加 入到5 个已 预热 的固 体平 板 中，每个 平板 中加入8.5 mL。待半固 体凝 固后，倒置 放入 生化 培养 箱，37 培养16 h24 h。B.4.6 在培养 基平 板上 选择 清晰 的噬菌 斑进 行计 数。应选 择噬菌 斑个 数介 于30300 的平板 进行 计数，若噬菌 斑个 数超 过300，则 应对样 品进 行进 一步 稀释 重新开 展实 验。每个 样品 对应5 个平板 的 噬菌 斑个 数分别记 为Plt1，Plt2，Plt3，Plt4 和Plt5。B.5 结果表 示与 计算 B.5.1 噬菌体MS2 效价 的计 算 每个样 品对 应 5 个 平板 的 噬菌斑 个数 分别 记 为 Plt1，Plt2，Plt3，Plt4 和 Plt5，则该 样品 中噬 菌体MS2 的 效价 可 按 公式（B.1）计算：式中：I 噬 菌体 效价，PFU/mL；V 样 品体 积，mL；Plt 平板 噬菌 斑 计 数，PFU。B.5.2 回收率 计算 医疗污 水中 病毒 检测 样品 制备过 程的 回收 率可 按 公 式（B.2）计算：式中：R 回收 率，%；I1 样品 制备 前噬 菌体MS2 的 效价，PFU/mL；I2 样品 制备 后噬 菌体MS2 的 效价，PFU/mL；V1 样品 制备 前的 体 积，mL；V2 样品 制备 后的 体 积，mL。DB32/T 3764-2020 10 参 考 文 献 1 HJ 493 水质 样品 的保 存 和管理 技术 规定 2 HJ 2029 医院 污水 处理 工 程技术 规范 3 DB32/T 3547 医 疗机 构废 水处理 及在 线 监 测技 术指 南 4 医院污 水处 理技 术指 南 环发2003 197 号 5 新型冠 状病 毒肺 炎暴 露风 险防范 手册 环 保相 关从 业人员，中 国环 境出 版社，2020 6 新型冠 状病 毒污 染的 医疗 污水应 急处 理技 术方 案（试行）环办 水体 函2020 52号 7 新冠病 毒疫 情环 境风 险防 控与应 急管 理技 术手 册（第一版），国 家长 江生 态 环境保 护修 复联 合研 究中心主 编，2020 8 Ahmed W,Harwood V J,Gyawali P,et alparison of concentration methods for quantitative detection of sewage-associated viral markers in environmental watersJ.Appl.Environ.Microbiol.2015,81(6):2042-2049 _