ICS 65.020.20 CCS B 05 山东省地方标准 DB37/T 3690.3 2020 37 液体菌种 制备技术 规程 第3 部分：平菇 Technical specifications for the preparation of liquid spawn Part 3:Pleurotus ostreatus 2020-12-04 发布 2021-01-01 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB37/T 3690.3 2020 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 基 本要 求.2 4.1 工作 人员 卫生 要 求.2 4.2 场所 要求.2 4.3 厂房 要求.2 4.4 生产 设施 与设 备要 求.2 5 生 产技 术.3 5.1 工艺 流程.3 5.2 母种 活化.3 5.3 摇瓶 液体 菌种 生产.3 5.4 发酵 罐液 体菌 种生 产.4 5.5 贮藏.5 6 生 产档 案.6 附录A（规 范性）平菇 液体菌 种生 产记 录事 项.7 DB37/T 3690.3 2020 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。本文件 是DB37/T 3690 液 体菌种 制备 技术 规程 的 第3部 分。DB37/T 3690 已 经发布 了以 下部 分：第1 部 分：香菇；第2 部 分：黑木 耳；第3 部 分：平菇；第4 部 分：灵芝。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由山 东省 农业 农村 厅提出 并组 织实 施。本文件 由山 东省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本文件 起草 单位：山东 省 农业技 术推 广总 站、泰 安 市农业 科学 研究 院、山 东 省农业 科学 院农 业资 源与环境 研究 所、济南 市农 业技术 推广 站、菏泽 市定 陶区特 色农 产品 服务 中心。本文件 主要 起草 人：赵淑 芳、高 瑞杰、高 霞、王庆 武、高 中强、司 元 明、张 燕、崔 慧、桑卫 民、黄春燕、韩建 东、王晓 婷、彭玮航、孙 振福、张 晓雱、马化 彬。DB37/T 3690.3 2020 1 液 体菌种 制备技术 规程 第 3 部分：平菇 1 范围 本文件 规定了 平菇（Pleurotus ostreatus）液体 菌 种的术 语和定 义、基 本要 求、生 产技术 和生 产档案管 理等 要求。本文件 适用 于平 菇液 体菌 种的制 备。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 150.1 压力 容器 第1 部分：通用 要求 GB 4789.28 食 品微 生物 学检验 培养 基和 试剂 的质 量要求 GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB/T 12728 食 用菌 术语 GB 19172 平菇 菌种 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 3 术语和 定义 GB/T 12728 界定 的以 及下 列术语 和定 义适 用于 本文 件。3.1 食用菌 液体 菌种 发酵 罐 edible mushroom liquid spawn fermenter 进行食 用菌 液体 菌种 培养 的专用 发酵 设 备，是利 用 生物发 酵原 理，给 菌丝 生 长提供 最佳 的营 养、酸碱度、温 度、供 氧量 等生 长 条件，使 菌丝 快速 生长，迅 速扩繁，在短 时间 达到 一 定菌球 数量 的专 用容 器。3.2 罐压 jar pressure 在液体 菌种 发酵 制备 过程 中发酵 罐内 保持 的空 气压 力（表 压）。注：单位为MPa。3.3 通气量 ventilation volume 在液体 菌种 培养 过程 中发 酵罐体 积与 每分 钟通 入发 酵罐中 无菌 空气 体积 的比 例。注：用 V/V（发酵罐体积/通入空气 体积）表示。3.4 接种量 inoculation amount 液体菌 种体 积与 培养 基体 积的比 例。注：用百分数表示。DB37/T 3690.3 2020 2 3.5 液体菌 种菌 龄 period of liquid spawn running 液体菌 种接 入培 养基 开始 计算的 液体 菌种 培养 时间。3.6 发酵罐 空消 empty fermenter sterilization 对尚未 加水 投料 的空 发酵 罐进行 高压 灭菌。3.7 发酵罐 实消 fermenter sterilization 对投料 后的 发酵 罐进 行高 压蒸汽 灭菌。3.8 空气过 滤器 air filter 能对食 用菌 液体 菌种 发酵 罐所用 空气 进行 滤除 杂菌 和其他 杂质，达 到无 菌洁 净要求 的设 备。3.9 摇瓶液 体菌 种 liquid spawn in shake flask 装至玻 璃菌 种瓶 内在 磁力 搅拌器 或恒 温摇 床上 培养 的液体 菌种。3.10 终止 pH initial pH value of medium 液体菌 种达 到放 灌指 标时 的培养 基pH。4 基本要 求 4.1 工作人 员卫 生要 求 工作人 员应 该保 持个 人卫 生，进 液体 菌种 发酵 车间 应穿戴 经消 毒处 理的 工作 服、口 罩、鞋、帽等。4.2 场所要 求 生产场 所应 符合NY/T 528 的环境 卫生 要求，场 地开 阔、路 面硬 化。生产 用水 应符合GB 5749 要求。4.3 厂房要 求 4.3.1 厂房设 计应 符 合NY/T 528 环境卫 生要 求，增设 摇瓶 菌种培 养室、发 酵罐 菌种 培养室。4.3.2 应设置 与工作 人员 数量相 适应的 更衣室，车 间入口 处应设 置洗手、消 毒和干 手设施。过道 应 设置风淋 室。4.3.3 车间地 面应能 防水、防腐 蚀、防 渗漏、防滑，易清 洗，有 适当的 排水 坡度（1.0 1.5）和良好的 排水 系统；墙 壁和 天花板 应能 防潮、防 霉、防水。4.3.4 车间安 装排 气管 道或 者排 风设备。4.3.5 摇瓶菌 种培 养室、发 酵罐 菌种培 养室 应符 合GB 50073 要 求。4.3.6 车间设 封闭 式废 物桶。4.4 生产设 施与 设备 要求 4.4.1 生产设 施 培养基 配制 室、摇瓶 菌种 培养室、发 酵罐 菌种 培养 室规模 要配 套，布局 合理，摇瓶 菌种 培养 室、发酵罐菌 种培 养室 要有 调温 设施，其中 培养 基配 制室 空间洁 净度 应达 到万 级以 上。菌 种检 验室 和 母 种 制 作室要有 相应 的实 验检 测设 备和制 种用 的灭 菌设 施。DB37/T 3690.3 2020 3 4.4.2 生产设 备与 用具 应具有 称量 器、高压 蒸汽 灭菌锅、液 体菌 种发 酵罐、液体 菌种 接种 器、超 净 工作台、调 温设 备、除湿设备、恒 温培 养箱、恒 温 摇床 或磁 力搅 拌器、冰 箱、显 微镜 等及 常规 用具。压力 容器 应经 政 府 有 关 部门检验 合格，符 合GB 150.1 的要 求。应具 有 备 用电 源。5 生产技 术 5.1 工艺流 程 工艺流 程见 图1。图1 平菇液 体菌 种生 产工 艺流 程 5.2 母种活 化 母种活 化配 方及 操作 流程 应符合NY/T 528 要求。活 化后母 种质 量应 符合GB 19172 要 求。5.3 摇瓶液 体菌 种生 产 5.3.1 容器要 求 使用无 色或 近无 色专 用玻 璃菌种 甁，可用 棉塞（梳 棉或化 纤棉）、硅胶 塞、专用封 口透 气膜 封口。5.3.2 培养基 配方 宜选用 以下 配方，且 培养 基质应 符合NY/T 528 要求：a)配方1：马 铃薯（煮 汁）200 g/L、葡 萄糖20 g/L，pH 自然；b)配方2：葡萄 糖20 g/L、蛋 白胨3 g/L、磷酸 二氢 钾 1 g/L、硫 酸镁0.5 g/L、维 生 素B1 5 mg/L，pH 自 然；c)配方 3：马铃 薯（煮汁）200 g/L，葡 萄 糖 20 g/L，磷酸二 氢 钾 1 g/L、硫酸 镁 0.5 g/L，维 生素B1 10 mg/L，pH 自 然。5.3.3 培养基 配制 按液体 培养基 配方 配制，混合均 匀，装 入摇 瓶中，装液量 为摇甁 容量 的50%60%，瓶塞 封口，并用报纸 或牛 皮纸 包扎。5.3.4 灭菌 DB37/T 3690.3 2020 4 将分装 好的 摇瓶 放入 灭菌 锅内，锅内 留有 一定 的空 隙。检 查锅 内水 位，立即 灭菌。灭菌 蒸汽 压 力 升至0.11 MPa 0.13 MPa，恒 压维持20 min 30 min。5.3.5 接种 待培养 基冷 却至 室温，在 无菌条 件下，用 接种 针挑 取56块（3 5）mm（3 5）mm 的母 种块 迅速转接于 摇甁 培养 基内，封 口。5.3.6 摇瓶液 体菌 种培 养 23 25 条 件下，静 置 培养 24 h，然后 置于 摇床 上震荡 培养，转 速140 r/min 160 r/min，培养时间4 d 6 d。5.3.7 摇瓶液 体菌 种质 量要 求 菌液澄 清透 明，菌丝 体分 布均匀，无 异味，有 平菇 特有的 香气；镜 检无 杂菌、菌丝 形态 正常。5.4 发酵罐 液体 菌种 生产 5.4.1 发酵罐 空消 发酵罐 初次 使用、出现 杂 菌、长期 放置、更 换品 种等 情况出 现其 一时，应空 消。蒸气压 力0.14 MPa、温度126，维 持40 min。5.4.2 发酵罐 液体 菌种 培养 基配 方 宜选用 以下 配方，且 培养 基质应 符合NY/T 528 要求：a)配方1：马 铃薯（煮 汁）200 g/L、葡 萄糖20 g/L、消泡 剂0.3 g/L，pH 自然；b)配方2：葡萄 糖20 g/L、蛋 白胨3 g/L、磷酸 二氢 钾 1 g/L、硫 酸镁0.5 g/L、维 生 素B1 5 mg/L、消泡 剂0.3 g/L，pH 自然；c)配方 3：马铃 薯（煮汁）200 g/L、葡 萄 糖 20 g/L、磷酸二 氢 钾 1 g/L、硫酸 镁 0.5 g/L、维 生素B1 10 mg/L、消泡 剂 0.3 g/L，pH 自 然。5.4.3 上罐、定容 用水把 原料 搅拌 均匀，加 入罐内，装 液量 为罐 体容 量的70%80%，通 入空 气 搅拌1 min 2 min，混合均匀，拧 紧上 料口 盖。5.4.4 发酵罐 实消 发酵罐 夹套通入冷水，水位低于 排水口20 cm，关闭进水阀、排水阀后加热。待夹套 蒸汽压力达到0.05 MPa 时，缓 慢打 开排 气 阀降压 至0 MPa，关 闭排 气 阀，再 次升 压至0.1 MPa 0.14 MPa；待发 酵罐 罐内蒸汽压 力达 到0.05 MPa 时，缓慢打 开排 气阀 降压 至0 MPa，关 闭排 气阀，再 次升 压 至0.11 MPa 0.12 MPa，同时打 开空 气过 滤器 灭菌，微开 排气 阀，维持50 min 60 min。5.4.5 冷却 灭菌结 束，关闭空气过 滤器灭菌 阀与排气阀，缓 慢打开夹 套排气阀降压至0 MPa，通 入冷水降温；同时缓 慢打开 发酵 罐罐内 排气阀 降压，待压 力接近0.02 MPa0.04 MPa 时向 罐 内通入 无菌空 气，调整排气阀，维持 罐压0.04 MPa 0.05 MPa，培 养液 温度 降至25 以下 时，关闭 夹 套进水 阀。5.4.6 接种 DB37/T 3690.3 2020 5 将摇瓶 接种管 和发 酵罐接 种口用75%酒 精消 毒，用95%酒精 的火 焰圈套 在接 种 口上，轻微打 开呼 吸器阀门，使发酵 罐罐 内压 力为0.01 MPa。点燃 火焰 圈，在 火焰 保护下 用镊 子去 掉接种 管上 的牛 皮纸 和 瓶塞，打 开接种 口阀 门，将 接种管 插入接 种口，将摇 瓶菌种 注入发 酵罐。接种 量为0.5%1.0%。拔 出 接种管，关闭 接种 阀门，去 掉火焰 圈，继续 通入 无菌 空气。5.4.7 发酵培 养 根据菌 丝生 长情 况，适时 调节进 气阀 门，通入 适量 无菌空 气，通气 量一 般为1：0.81：1，同时 调节排气 阀，维持 罐压0.02 MPa 0.05 MPa，培 养温 度 控制在23 25，培 养5 d7 d。5.4.8 发酵罐 液体 菌种 质量 标准 5.4.8.1 感官要 求 感官指 标应 符合 表1 的规 定。表1 平菇发 酵罐 液体 菌种 感官 要求 项目 要求 菌液色泽 菌丝体呈白色，菌液呈淡黄色 菌液形态 菌液粘稠不分层，菌丝体分布均匀 菌液气味 有平菇液体培养时特有的香气，无异味，发酵罐排气口气味正常 显微镜下菌丝形态 菌丝粗壮，有隔膜，可见锁状联合 5.4.8.2 理化指 标 理化指 标应 符合 表2 的规 定。表2 平菇发 酵罐 液体 菌种 理化 指标 项目 要求 终止 pH 5.5 6.5 菌丝湿重（mg/mL）50 5.4.9 液体菌 种检 测 5.4.9.1 形态学 观察。主 要是 通过 肉眼观 察菌 球形 态，通过 显微镜 观察 菌丝 体形 态。5.4.9.2 霉菌检 验。按照 无菌 操作 从 取样阀 取少 量培 养液，接 种 于GB 4789.28 中规 定的PDA 培养基 中，置于 28 30 恒 温培 养 48 h，采用 显微 镜和感 官观察 菌丝 生长 状况 和有 无霉菌 污染，必要 时 进 行 水封片镜 检。5.4.9.3 细菌检 验。按 照无 菌操作 从取样 阀取 少量 培养 液，接种 于 GB 4789.28 中规 定 的营养 肉汤 培 养液中，置 于28 30 恒温培 养 24 h48 h，观 察是否 有细 菌污 染,必要 时 进行镜 检和 划线 培养 检 验。5.4.9.4 pH 测 定。取样 用 pH 计或pH 试纸 测定 菌液 酸碱 度。5.4.9.5 菌丝湿 重测 定。称取 一定 体积的 培养 液，经 10 000 r/min 离心5 min，称重。5.5 贮藏 DB37/T 3690.3 2020 6 平菇液 体菌种生产后应立即使用，如不能立即使用，需进 行贮藏。贮藏环境温度低 于20。发酵罐内液 体菌 种，持续 通无 菌空气，保 持罐 压0.02 MPa 0.03 MPa，可存 放2 d。6 生产档 案 母种、摇瓶液 体菌 种和发 酵罐液 体菌种 生产 的 每个 环节都 要有详 实的 记录，记 录内 容应按 附录A 执行。生 产记 录归 档保 存，至少2 年。DB37/T 3690.3 2020 7 附录A（规范 性）平菇液 体菌 种生 产记 录事 项 平菇液 体菌 种生 产记 录事 项如下：a)生产投 入品 使用 情况（包 括液体 菌种 的制 作培 养基 质、营 养辅 料、所用 菌种、菌瓶）：1)名称；2)来源；3)用法、用量；4)使用、停用 的日 期。b)菌种生 产（培养 基制 作、灭菌、接种、培 养）及杂 菌发生 情况：1)培养基 制作；2)高压灭 菌；3)接种；4)培养。c)贮藏过 程及 杂菌 发生 情况；d)主要菌 种生 产设 备及 用具：1)主要菌 种生 产设 备；2)主要菌 种生 产用 具。e)生产场 所名 称、菌种 数量、记录 人、入档 日期。