ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 30892019 羊传染性脓疱病毒检测 荧光PCR探针法 TaqMan probe-based real-time PCR assay for detection of orf virus 2019-12-25发布 2020-02-01实施吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/30892019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：邵洪泽、王楠、王龙涛、王开、程荣华、柴方红、于钦磊、董航、葛永明、呼延含蓉、任锐、王欣宇。DB22/T 30892019 1 羊传染性脓疱病毒检测 荧光PCR 探针法 1 范围 本标准规定了羊传染性脓疱病毒（ORFV）ORF059基因荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于羊传染性脓疱病毒基因的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 3235 羊传染性脓疱诊断技术 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。ORFV：羊传染性脓疱病毒（Orf virus）ORF：开放阅读框（Open Reading Frame）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）Ct：循环阈值（Cycle threshold）4 原理 根据羊传染性脓疱病毒（ORFV）ORF059基因序列设计引物和探针，探针在5端标记FAM荧光素作为报告荧光基团，3端分别标记TAMRA作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5 3的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。5 试验条件 5.1 生物安全要求 所有培养物和废弃物的处置应符合GB 19489的规定。5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。DB22/T 30892019 2 6 试剂和材料 6.1 试剂 6.1.1 病毒 DNA 提取试剂盒。6.1.2 TapPath Master Mix。6.1.3 阳性对照：灭活的羊传染性脓疱病毒细胞培养物。6.1.4 阴性对照：不含羊传染性脓疱病毒细胞培养液。6.1.5 空白对照：ddH2O。6.2 耗材 6.2.1 吸头，200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L。6.2.2 离心管，1.5 mL。6.2.3 荧光 PCR 反应管，根据荧光 PCR 仪要求选择单管、八连排管或 96 孔荧光反应板。6.3 引物和探针 根据羊传染性脓疱病毒（ORFV）ORF059基因序列设计合成一对特异性引物和探针。上游引物 5-TTGCACATGTCCGTGAAGAAGT-3。下游引物 5-AGGCGGTGGAATGGAAAGAC-3。TaqMan 探针（FAM）5-CGGGTAGTCTTTGGAGTC-3（TAMRA）。均配制成 20 mol/L，-20 避光保存，6个月内使用。7 仪器 7.1 冰箱，-202。7.2 低温高速离心机，不低于 12 000 r/min。7.3 可调微量移液器，200 L1 000 L、20 L200 L、2 L20 L、0.5 L10 L。7.4 荧光 PCR 仪。8 样品 样品的采集和处理按 NY/T 3235 规定进行。9 操作步骤 9.1 模板的制备 采用病毒DNA提取试剂盒（6.1.1）提取（6.2.1、6.2.2、7.2、7.3）待检样品的核酸作为模板。阳性对照（6.1.3）、阴性对照（6.1.4）均按照待检样品提取方法进行操作。9.2 反应体系 用可调微量移液器（7.3）按表1中各组分依次加入荧光PCR反应管（6.2.3）后瞬时离心。同时设阴性对照、阳性对照、空白对照。DB22/T 30892019 3 表1 荧光 PCR 反应体系 成分 用量 L TapPath Master Mix（5 U/L）10.0 上游引物（20 mol/L）1.0 下游引物（20 mol/L）1.0 TaqMan探针（20 mol/L）0.5 模板 1.5 ddH2O 6.0 总计 20.0 9.3 反应参数 将 9.2 中离心后的荧光PCR反应管（6.2.3）放入荧光PCR仪（7.4）内，记录样品摆放顺序。循环参数设置如下：第一阶段，预读 60 30 s；第二阶段，预变性 95 5 min；第三阶段，95 15 s、60 30 s，40 个循环。荧光收集设置在第三阶段每次循环60 30 s 时进行。10 结果判定 10.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。10.2 质控标准 10.2.1 空白对照、阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。10.2.2 阳性对照的 Ct 值应30，并出现特定的扩增曲线。10.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此试验视为无效。10.3 结果描述及判定 10.3.1 阴性判定 无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无 ORFV 核酸。10.3.2 阳性判定 Ct值35，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在ORFV核酸。Ct值35，且出现典型扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的，判定为阳性。_