ICS 65.020 B 01 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3894 2020 大白菜芜 菁花叶病 毒、黄 瓜花 叶病毒检 测技术规程 Detection and identification of turnip mosaic virus and cucumber mosaic virus in Chinese cabbage 2020-03-31 发布 2020-05-01 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB 37/T 38942020 I 前 言 本标准 按GB/T 1.1-2009 给 出的规 则起 草。本标准 由山 东省 农业 农村 厅提出 并组 织实 施。本标准 由山 东省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：山 东省 农业科 学院 植物 保护 研究 所。本标准 主要 起草 人：吴斌、辛相 启、王升 吉、姜珊 珊、张 眉、辛志 梅。DB 37/T 38942020 1 大 白菜芜 菁花叶病 毒、黄 瓜花叶病 毒检测 技 术规程 1 范围 本标准 规定 了大 白菜 中芜 菁花叶 病毒、黄 瓜花 叶病 毒的间 接ELISA、Dot-ELISA 和普 通RT-PCR 检测 方法。本标准 适用 于山 东省 芜菁 花叶病 毒、黄瓜 花叶 病毒 在传播 介体 蚜虫 和大 白菜 中的检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682-2008 分 析实 验 室用水 规格 和试 验方 法 3 样品采 集与 保存 3.1 蚜虫样 品采 集 在蚜虫 盛发 初期 进行 蚜虫 样品采 集，于 白菜 田、周 边 蔬菜田 或田 间杂 草丛 等蚜 虫喜好 栖息 环境，采用直径33cm 的35目 纱网 在 田间随 机进行 扫扑，分拣 装入试 剂瓶中，100%乙 醇 浸泡，-20 以下冰 箱保 存备用。3.2 叶片样 品采 集 采集表 现TuMV 和CMV 花叶、皱缩、植株 矮化、畸 形等 典型症 状的 大白 菜叶 片5g 10g，单 株样 品袋 存放。样 品采 集后，在 冷藏 条 件下（2 C8 C）运送 至实 验室。如果 样品 在2 天内 检 测，可 暂时 储存 于2 C 8 C冷藏箱；如果 样品 在2 天以后 检测，保 存至-80 超低温 冰箱 备用，样 品避 免反复 冻融。4 主要仪 器设 备、用具 和试 剂 4.1 仪器设 备 仪器设 备主 要有：a)酶标仪；b)洗板机；c)电子天 平（感 量0.001g）；d)PCR 仪；e)电泳仪；f)水平电 泳槽；g)凝胶成 像仪；h)高速冷 冻离 心机；i)水浴锅；DB 37/T 38942020 2 j)样品冷 藏柜；k)低温冰 箱（-20 C）；l)超低温 冰箱（-80 C）；m)磁力搅 拌器；n)高压灭 菌锅；o)可调微 量移 液器（10L、100L、200L、1000L）。4.2 用具 用具主 要有：a)无RNase 吸 头（10L、100L、200L、1000L）；b)酶标板；c)硝酸纤 维素 膜（NC 膜）；d)无RNase 离 心管；e)PCR 反 应管；f)研钵；g)样品袋；h)标签；i)镊子。4.3 主要试剂 TuMV抗 体、CMV 抗体、酶 标 二抗、TuMV 特异 性引 物、CMV 特异 性引 物、Trizol、液氮、三氯 甲烷、异丙醇、乙醇、M-MLV RT 反 转录酶、RNA 酶抑制 剂、Taq DNA 聚 合酶、DNA 分子标 记、Gelred、琼脂 糖等。除特殊 说明 外，所有 实验 用试剂 级别 均为 分析 纯级。试验用 水为 无菌 超纯 水或 去离子 水，均符 合GB/T 6682-2008。血清学 和分 子生 物学 检测 试剂配 制见 附录A。5 检测 5.1 方法提 要 芜菁花 叶病 毒、黄瓜 花叶 病毒 的 血清 学特 性与 分子 生物学 特性 是该 病毒 检测 方法的 主要 依据。两 种病毒都 具有很 强的免 疫原 性，同 时都是RNA 病 毒，因 此可利 用间接ELISA、Dot-ELISA 和RT-PCR方 法确 定样品中 是否 带有 上述 两种 病毒。5.2 间接酶 联免 疫吸 附测 定 5.2.1 样品制 备 将单头 蚜虫 置于 小型 离心 管内，加300L包被 缓冲 液 研碎，4 C冰箱 放置12h 16h；称取 待测 植株 样品0.1g 以上，按1：10（质 量：体 积）加入 包被 缓冲 液，用 研钵 研磨 成浆，4 C冰箱放 置4h 5h。将 两 类研磨液8000r/min离心3min，上清 液即 为制 备好 的检 测样品。设阴性 对照 和阳 性对 照，阴性对 照样 品为 试验 室保 存的未 感染 病毒 的健 康大 白菜叶 片，阳性 样 品 为试验室 保存的 感染TuMV或CMV 的标 准样品，阴 性样品 及阳性 样品皆 通过RT-PCR 检测及 测序验 证。阴性对照、阳 性对 照作 相 同 的处 理，样 品提 取缓 冲液 作空 白对照。5.2.2 加样 DB 37/T 38942020 3 在 酶标 板 上 加入 制备 好的 待检测 样品、阴 性对 照、阳性对 照、空白 对照，每 个样品 平行 加到 两 个 孔中，每 孔加 样100L，加盖，4 C冰箱孵 育12h 16h。5.2.3 洗板 孵育结 束后，用PBST 清洗 酶标板3次5次。每 孔每 次加PBST洗液700L，每 次 停留1min 2 min。5.2.4 加抗血 清 用抗体 稀释 缓冲 液按 照相 应病毒 抗血 清的 使用 浓度 进行稀 释，每孔 加入 稀释 好的抗 体液100L，加盖，37 C孵育1.5h。5.2.5 洗板 同5.2.3。5.2.6 加酶标 抗体 用抗体 稀释 缓冲 液将 酶标 抗体稀 释至 工作 浓度，并 加 入到 酶联 板中，100L/孔，加 盖，37 C孵育1.5 h。5.2.7 洗板 同5.2.3。5.2.8 加底物 缓冲 液 将现配 的底 物缓 冲液 按100L/孔，加 入到 酶联 板中，室温避 光孵 育1h。5.2.8.1 读数 每孔加100 L3 mol/L NaOH 终止 剂终 止反 应，用酶 标 仪在405nm 波长 下测 定各 孔 的吸光 值（OD405）。5.3 斑点酶 联免 疫吸 附测 定 5.3.1 NC 膜 制备 剪裁7cm7cm 大小 的NC 膜，用铅笔 在保 护纸 外划 成7mm7mm 大小 的方 格，划好 后 去掉保 护纸 备用。5.3.2 样品制 备 将单头 蚜虫 置于 小型 离心 管内，加300 LPBS 磷 酸盐 缓冲液 研碎；称 取待 测植 株样品0.1g 以上，按1：10（质 量：体 积）加 入PBS 磷酸盐 缓冲 液，用研 钵研 磨成浆。将 两类 研磨 液8000r/min 离心3min，上 清液即为制 备好 的检 测样 品。设阴性 对照 和阳 性对 照，阴性对 照样 品为 试验 室保 存的未 感染 病毒 的健 康大 白菜叶 片，阳性 样 品 为试验室 保存的 感染TuMV 或CMV 的标 准样品，阴 性样品 及阳性 样品皆 通过RT-PCR 检测及 测序验 证。阴性对照、阳 性对 照作 相 同 的处 理，样 品提 取缓 冲液 作空 白对照。5.3.3 加样 分 别取2L制 备好 的 待 检测 样品、阴性 对照、阳 性对 照、空 白对 照，点到NC膜 的相应 格子 中，室 温干燥10min。每 个样 品平 行 在膜上 重复 一次。5.3.4 封闭 DB 37/T 38942020 4 在平皿（F9cm）中加 入20mL封闭 液，并将 干燥 好的NC膜浸入，室 温下 封闭30min。5.3.5 加抗血 清 用封闭 液按 照相 应病 毒抗 血清的 工作 浓度 进行 稀释，并将NC膜 浸入，室 温孵 育30min 60min。5.3.6 洗膜 将平皿 中抗 体液 倒出，加 入PBST 20mL洗膜3次4 次，每次3min。5.3.7 加酶标 抗体 用抗体 稀释 缓冲 液按 说明 将酶标 抗体 稀释 至工 作浓 度，并将NC 膜浸 入，室温 孵育30min 60min。5.3.8 洗膜 同5.3.6。5.3.9 显色 显色底 物NBT 66L 和BCIP 33L加到10mL 底 物缓 冲液 中混匀，洗 好的 膜用 滤纸 吸干后 放入 底物 显 色液中反 应，待 阳性 对照显 色明显，而阴 性没 有任何 显色时 终止反 应（显色5min 20min），即在 蒸馏 水中漂洗，肉 眼观 察并 记录 结果。5.4 逆转录-聚 合酶 链式 反应 检 测 5.4.1 总RNA 提取 取单头 蚜虫或 称取0.1g 植 物组织 加液氮 研磨 成粉末 状，迅 速将其 移入 灭菌的 无RNase 1.5mL离心管中，加人1mL 的Trizol 试剂，剧 烈振 荡摇 匀，室 温静 置5 min；4 C，12000g 离心10min，取上 清液；加 入200L 三氯 甲烷，上下 颠倒 混匀，室温 静止15min；4 C，12000g 离心10min，取 上层水 相移 入新 的离 心 管中；加等 体积 的异 丙醇（约600L），轻柔 颠倒 混匀，室 温放 置15min；4 C，12000g 离心10min，小心 弃上清液；加1mL 预冷 的75%的 乙醇洗 涤沉 淀，4 C，7500g 离心5min，弃 乙醇；沉 淀于 室温下 干燥5min 10min，溶于30L无RNase 的ddH2O，轻弹管壁使 之溶解，-80 C 保存备用。设阴性对照 和阳性对照，阴性对照 样品为试 验室 保存 的未 感染 病毒的 健康 大白 菜叶 片，阳 性样品 为试 验室 保存 的感 染TuMV 或CMV 的 标准 样品，阴性样 品及 阳性 样品 皆通 过RT-PCR 检 测及 测序 验证，用 超纯 水作 空白 对照。阴 性对照、阳性 对照 作相 应的处理。5.4.2 引物合 成 委托引 物合 成公 司进行 引 物合成，引 物配 制成10mol/L 储 存液 备用，引 物序 列 见表1。表1 检测引 物序 列 检测病 毒 引物名 称及 序列 扩增片 段大 小 芜菁花 叶病 毒 TuMV-F:5-GTAACCAAGACCGACCATAC-3 228bp TuMV-R:5-TATGCCTCTCCGTGTTCT-3 黄瓜花 叶病 毒 CMV-F:5-AACCACCCAACCTTTGTAG-3 460bp CMV-R:5-GCTCGACGTCAACATGAA-3 5.4.3 逆转 录 DB 37/T 38942020 5 逆 转 录 总 体 积 为20L。在无RNase 的PCR 管 中 依 次 加 入3L 待检测RNA，1L 相 应 病 毒 下 游 扩 增 引 物（20M），8L 无RNase 的ddH2O，在65 C 恒温水浴，放置5 min 后 迅速 置于 冰上5min。再向PCR 管 中加 入M-MLV RT（200U/L）1 L、RNasin（40U/L）1L、5RT 缓 冲液4L、dNTP（10mmol/L）2L，混 匀，置于PCR仪中42 C 反应1h，70 C 反应5min。同样处 理阳性对照、阴性对 照和空 白对照，合成的cDNA置于-20 C 以下冰箱 中保 存备 用。5.4.4 PCR 扩增 依次在灭菌的PCR 管 中加 入ddH2O 14.8L、10PCR 缓冲 液2.5L、MgCl2（25mmol/L）2.5L、dNTP（10mmol/L）2L、10pmol/L 上游 引物1L、10pmol/L 下 游引物1L、Taq 酶（5U/L）0.2L、cDNA 模板1L，混 匀。置于PCR 仪 中，设 置反 应程 序95 C 5min，95 C 30s，56 C 30s，72 C 1min，35 个循 环 后72 C 10min，4 CPCR仪中 保存。5.4.5 琼脂糖 凝胶 电泳 检测 制备1%的 琼脂 糖 凝胶。取上 述PCR 产 物10L，加入1L 上 样缓 冲 液，混匀 后移 入胶 孔，并 在样 品孔一侧加 入DNA 分 子量 标记，120V 电 压下 电泳30min。电 泳结束 后，在 凝胶 成像 仪 的紫外 透射 光下 观察 是否扩增出 预期 的特 异性 条带，并与 阳性 对照 比较，拍 摄并记 录。6 结果判 定及 表述 6.1 结果判 定 6.1.1 间接酶 联免 疫吸 附测 定 6.1.1.1 对照孔 的 OD405 值（缓冲 液 孔、阴 性对 照及 阳性 对照 孔），应该 在质 量控 制范 围内，即：a)缓冲液 孔和 阴性 对照 孔 的OD405 值2；d)孔的重 复性 基本 一致。以上同 时具 备则 本批 次检 测有效，否 则判 定本 批次 检测无 效，需重 新检 测。6.1.1.2 在满足 了质 量控制 要 求后，结果 原则 上可 判断 如下：a)样品 OD405 值/阴性 对照 OD405 值2，判为 阳性；b)样品 OD405 值/阴性 对照 OD405 值=2，判为 可疑 样品，需 重新做 一次，或 用其 他方 法验证；c)样品 OD405 值/阴性 对照 OD4052，判为 阴性。6.1.2 斑点酶 联免 疫吸 附测 定 肉眼观 察，阳性 对照 应出 现棕红 色或 深褐 色圆 形斑 点，阴 性对 照应 无显 色斑 点。对照成 立的 情况 下，肉 眼 观察各 个被 检测 样品，凡 出现棕 红色 或深 褐色 圆形 斑点者 判为 阳性，与阴性对照 相同 不出 现可 见斑 点者判 为阴 性，介于 两者 之间判 为可 疑，需重 新做 一次，或用 其他 方 法 验 证。重复孔 结果 不一 致时，视 此次结 果无 效，需进 行重 新验证。6.1.3 逆转录-聚 合酶 链式 反应 根据阳 性对 照、阴性 对照 和空白 对照 的电 泳图 表现 判断检 测是 否有 效，如无 效时，则需 重 新 检 测。如果阴 性对 照和 空白 对照 正确，待测 样品 出现 与阳 性对照 一致 的所 测病 毒的 扩增条 带，判定 结 果 为阳性。DB 37/T 38942020 6 阳性对 照、阴性 对照 和空 白 对照 正确，且 样品 无扩 增条带，判 定结 果为 阴性。6.2 结果表 述 检测 结 果表 述如 下：a)检出芜 菁花 叶病 毒 或 未检 出 芜菁 花叶 病毒；b)检出黄瓜 花 叶病 毒或 未检 出 黄瓜 花叶 病毒。DB 37/T 38942020 7 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂配 制 A.1 间接酶 联免 疫吸 附测 定 A.1.1 包被缓 冲液（pH9.6）碳酸钠（Na2CO3）1.59g，碳酸氢 钠（NaHCO3）2.93g，溶 解于900mL 蒸馏 水中，用盐酸 调节pH至9.6，用蒸馏 水定 容至1000mL。A.1.2 PBST缓 冲液（pH7.4）氯化钠（NaCl）8.0g，磷 酸二氢 钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢 二钠（Na2HPO4）1.15g，氯 化钾（KCl）0.2g，0.5mL Tween-20，溶解于900mL 蒸 馏水 中，用 盐酸调 节pH 至7.4，蒸馏 水 定容至1000mL。A.1.3 抗体缓 冲液 PVP（MW 24 4000）（聚乙烯 吡络 烷酮）2g，脱 脂奶粉1g，溶解 于100mL PBST 中。A.1.4 底物稀 释缓 冲液（pH9.8）二乙醇 胺9.7mL，氯 化镁（MgCl2）0.01g，溶 解于80mL 蒸馏水 中，用 盐酸 调节pH 至9.8，用 蒸馏 水定容至100mL。A.1.5 底物溶 液（现配 先用）1mg PNPP（对-硝基 苯磷 酸 二钠）溶于1mL 底物 缓冲 液 中。A.1.6 抗血清 病毒 特 异性 抗体。A.1.7 酶标抗 体 碱性磷 酸酶 标记 抗体。A.2 斑点酶 联免 疫吸 附测 定 A.2.1 PBS磷 酸盐 缓冲 液（pH7.2）氯化钠（NaCl）8.0g，磷 酸二氢 钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢 二钠（Na2HPO4）1.15 g，氯 化钾（KCl）0.2g，溶解 于900mL 蒸馏 水 中，用 盐酸 调节pH至7.2，蒸馏水 定容 至1000mL。A.2.2 PBST缓 冲液（pH7.4）氯化钠（NaCl）8.0g，磷 酸二氢 钾（KH2PO4）0.2g，磷酸氢 二钠（Na2HPO4）1.15g，氯 化钾（KCl）0.2g，0.5mL Tween-20，溶解于900mL 蒸 馏水 中，用 盐酸调 节pH 至7.4，蒸馏 水 定容至1000mL。A.2.3 封闭液 DB 37/T 38942020 8 取脱脂 奶粉5g加 入到100mL PBST，充 分溶 解，4 C保 存。A.2.4 底物稀 释缓 冲液（pH9.5）Tris Cl 12.11g，氯化 镁（MgCl2）2.38g，氯 化钠（NaCl）5.85g，溶 解于900mL 蒸 馏水 中，用氢 氧化钠调 节pH 至9.5，用蒸 馏 水定容 至1000mL。A.2.5 底物溶 液（现配 先用）BCIP(5 0mg/mL)溶于100%二甲 基甲 酰胺；NBT(50mg/mLl)溶于70%二甲 基甲 酰 胺。每5 mL 底 物 稀释 缓 冲液 中先 加入33L 的NBT，混匀 后再 加 入16.5L的BCIP，该试 剂 配 制好 后，应在1h 内 使用。A.2.6 抗血清 病毒特 异性 抗体。A.2.7 酶标抗 体 碱性磷 酸酶 标记 抗体，为 病毒特 异性 抗体 的抗 体。A.3 逆转录-聚 合酶 链式 反应 A.3.1 50TAE Tris Cl 242g，冰乙 酸52.1mL，Na2EDTA 2H2O 37.2g，溶解于900mL 蒸 馏水 中，蒸 馏水定 容至1000mL。使用时 加水 稀释 至1TAE。A.3.2 上样缓 冲液 0.05%溴酚 蓝，0.9%SDS，50%甘油 水溶 液。_