ICS 07.080 B 41 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 5143 2019 畜禽组织 及体液中 多种抗生 素残留 快速检测 微生物抑 制法 2019-12-27 发布 2020-01-28 实施 河 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB13/T 5143 2019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由河 北省 农业 农村 厅提出。本标准 起草 单位：河北 省 兽药监 察所、河北 科星 药 业有限 公司、北京 中检 葆 泰生物 技术 有限 公司、邢台市 动物 卫生 监督 所、衡水市 农业 环境 与农 畜产 品质量 监督 管理 站、沧州 市农产 品质 量检 验监 测 中心、承 德市 畜禽 水产 品质 量检验 监测 中心、石 家庄 市畜产 品质 量监 测中 心、石家庄 市畜 牧兽 医技 术 开发中心、唐 山市 食品 药品 综合检 验检 测中 心。本标准 主要 起草 人：刘怡 菲、王 萍、王振 来、刘 龙 飞、牛 志勇、钱 春彩、段 培姿、王爱 卿、刘力、李云、张峰、闫 超、李海 龙、李 文香、李 研东、武 侠均、赵芳、崔 沙沙、陈 宝明、李肖 莉。DB13/T 5143 2019 1 畜 禽组织 及体液中 多种抗 生素残留 快速检 测 微 生物抑 制法 1 范围 本标准规定了畜禽组织及体液中-内酰 胺类、磺 胺类、氟喹 诺酮 类、四环 素类、大环 内酯 类、氨基糖苷类、酰 胺醇 类七 大类 抗生素 残留的微生物抑制法的制样和检测方法。本标准适用于畜禽肾脏、肝脏、肌肉、血清和尿液中-内酰胺 类、磺胺 类、氟喹 诺酮类、四 环素 类、大环内 酯类、氨 基糖 苷类、酰胺 醇类七大类抗生素残留的快速检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 注日 期的版 本适 用于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 原理 通过抑 制微 生物 生长 的检 测方法 来检 测畜 禽组 织或 体液中 的抗 生素。细 菌在 含有pH 指示 剂的 琼 脂中培养，使 用拭 子对 畜禽 组织或 体液 进行 提取，如 果样品 中不 含有 抗生 素，细菌生 长不 受抑 制，产 生的酸会 使含 有紫 色指 示剂 的琼脂 变成 黄色；如 果样 品中含 有抗 生素，细 菌生 长会受 到抑 制，指示 剂 显示紫色。4 试剂和 材料 除另有 说明 外，本法 所用 的试剂 确认 为分 析纯 试剂，水为符合GB/T 6682 规 定 的 二 级 水。4.1 检测试 剂盒 a)检测棒；b)取样拭 子；c)洗脱反 应缓 冲液；d)检测微 管（含有 微生 物的 固化培 养基）；e)阴性质 控片：冷 藏保 存（2 8）；f)阳性质 控片：青霉 素 G 标准品 固体；g)阳性质 控片:庆大 霉素 标 准品固 体；h)反应药 片：用于 尿液 和血 清样品 的检 测，冷藏 保存（28）。注：检测试剂盒是由Charm Science 公司提供的产品。给出这 一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。4.2 阴性质 控样 品制 备 DB13/T 5143 2019 2 4.2.1 组织类 阴性 质控 样品 制备：取 出 1 片阴 性质 控片（4.1.2）放 置在 提供 的带 有螺 帽的离 心管 中，加入1.0 mL 水，振荡10 s 使阴性 质控 片（4.1.2）充 分溶解。放 置5 min 后 再 次振荡，制 成阴 性质 控样品溶 液,冷藏 保存（28）,保 存期 为 5d。4.2.2 血清和 尿液 阴性 质控 样品：直接 使用 阴性 血清 或阴 性尿 液 样品 作为 阴性 质控 样品。4.3 阳性质 控样 品 的配 制（用于肾 脏、肝脏、肌 肉、家畜血 清和 尿液 样品 的测 定）：用 0.8 mL 阴性质控 样品（4.2）溶解 阳 性质控 片（4.1.3），制 成浓度 为 50 ng/mL 的阳 性 质控样 品。阳 性质 控样品 可冷 藏保 存（28）72 h；制 备后6 h 内 置于-15 以下 冷冻，可 保 存 3 周，解 冻的 阳性 质控样品 可冷 藏保 存（28）24 h。4.4 阳性质 控样 品 制备（用 于家禽 血清 样品 的检 测）：用10 mL 水溶 解阳 性质 控片（4.1.4），制得浓 度 为5000 ng/mL 的标准溶液。取 0.75 mL 上 述标准溶液，加入 4.25 mL 阴 性血清，制得 阳性 质控样品，庆 大霉 素浓 度 为750 ng/mL。5 仪器设 备 a)孵育 器：温度 设置641；b)结果判 读卡：见 附 录 B；c)离心机：最 高离 心力 大 于1200 g；d)移液 器及 吸头：100 L 1000 L、20 L 200 L 和1 mL 5 mL；e)离心 管：2 mL、10 mL 和50 mL。注：结果 判 读卡 是由Charm cience 公司 提供 的 产品。给 出 这一信 息 是为 了 方便 本标 准的 使 用者，并不 表 示对 该 产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的 产品。6 分析步 骤 6.1 试样制 备 6.1.1 肾脏和 肝脏 样品 制备 将取样拭子（4.1.1.1）从 检测棒中 拔出,使 用检测棒 露出的开 口端，插 入新鲜 的肾脏或 肝脏皮 质约1 cm 2 cm 做 环形 切割，取渗 出液 用于 检测。6.1.2 肌肉样 品制 备 将肌肉样 品匀质后 速冻，然后快速 解冻，将取样拭 子（4.1.1.1）从检测 棒中 拔出,使用 检测棒 露出的开 口端，插 入肌 肉组 织约1 cm2 cm 做环 形切 割，取 渗出 液用 于检 测。6.1.3 血清样 品制 备 将血液 收集于50 mL 离心 管（5.5）中，放置4 h，弃 去凝块，离心 剩余 液体（1200 g，5 min），收集上清 液。移取500 L上清 液至离心管中。加入反 应药片（4.1.5），盖上离 心管，10 s内点动式涡旋 混合10次，翻转35 次，确保 药片充 分溶 解。再次10 s 内点动 式涡 旋混 合10 次，静置1 min。6.1.4 尿液样 品制 备 DB13/T 5143 2019 3 移取500 L清 亮的 尿液 于 离心管 中（如 尿液 浑浊，则1200 g离心5 min，取 上 清液备 用），加 入反应药片（4.1.5）。盖上 离 心管，10 s 内 点动 式涡 旋 混合10 次，翻转35 次，确保药 片充 分溶 解。再次10 s 内点 动式 涡旋 混合10 次，静置1 min。6.2 样品移 取 6.2.1 肾脏、肝脏 和肌 肉样 品 握住取样 拭 子（4.1.1.1），将 棉签 头插 入肾 脏、肝 脏或肌 肉组 织的 环形 切口，顺 时针 移动 同时 旋转约30 s，使拭 子吸 附汁 液至完 全浸 湿，去除 拭子 上的组 织颗 粒。6.2.2 血清和 尿液 样品 打开离 心管，将取样 拭子（4.1.1.1）从 检测 棒中 拔 出，浸 入样 品上 清液 中，浸泡10 s。6.3 样品检 测 6.3.1 将孵育 器（5.1）设 置为64，待温 度稳 定后 进行 检测。6.3.2 垂直缓 慢旋 转手 柄，把取样 拭子（4.1.1.1）插 入检 测棒中，先 拧到 一半，使 拭子刺 破上 层密封箔膜 并完 全浸 没到 上层洗脱反应缓冲液(4.1.1.2)中，但 不刺 破下 层密 封箔 膜，等 待 2 min。旋 下拭子，使 拭子 到达 微管 底部 琼脂上 方，轻敲 微管 底部 使上层 液体 完全 进入 微管 底部，旋出 拭子，再 次 轻敲微管 底 部 5 次，按 照检 测试剂 盒标 注时 间孵 育。孵育结 束，取出 微管 放至 室温。7 结果判 定 与结果 判读 卡（5.2）进 行 颜色比 对，目视 判定。a)阴性：琼脂 颜色 为黄 色或 者黄/绿色 为阴 性结 果；b)可疑：琼脂 下半 部分 为黄 色或黄 绿色，上 半部 分为 蓝色/紫色 或棕 色为 可疑 结 果；c)阳性：琼脂 颜色 为蓝/紫 色 为阳性 结果。8 阳性样 品 和 可疑 样品 确认 当样品 检测 结果 判为 阳性 或可疑 时，应采 用 国 家标 准 方法 进行 确 证。9 检出限 方法检 出限 见表1。表1 方法检出限表 药物名称 英文名称 检出限(g/kg)肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清 家畜血清和尿液 青霉素 G Penicillin G 35 35 氨苄西林 Ampicillin 40 40 阿莫西林 Amoxicillin 40 40 DB13/T 5143 2019 4 表1 方法检出限表（续）药物名称 英文名称 检出限(g/kg)肾脏、肝脏、肌肉、家禽血清 家畜血清和尿液 氯唑西林 Cloxacillin 200 200 苯唑西林 Oxacillin 150 150 头孢噻呋 Ceftiofur*800 800 头孢匹林 Cephapirin*100 100 头孢氨苄 Cefalexin 150 150 头孢喹肟 Cefquinome 40 40 甲氧苄啶 Trimethoprim 40 40 磺胺二甲氧嗪 Sulfadimethoxypyrimidine 50 50 磺胺二甲嘧啶 Sulfadimidine 30 30 磺胺甲基异恶唑 Sulfisoxazole 70 70 磺胺甲氧嗪 Sulfamethoxypyridazine 70 70 磺胺甲嘧啶 Sulfamerazine 50 50 磺胺类 Sulfonamide 30 30 达氟沙星 Danofloxacin 40 40 二氟沙星 Difloxacin 200 200 恩诺沙星 Enrofloxacin 60 60 氟甲喹 Flumequine 400 400 沙拉沙星 Sarafloxacin 8 8 洛美沙星 Lomefloxaxin 1 1 氧氟沙星 Ofloxacin 1 1 诺氟沙星 Norfloxacin 1 1 培氟沙星 Pefloxacin 1 1 恶喹酸 Oxolinic Acid 80 80 土霉素 Oxytetracycline 150 150 四环素 Tetracycline 100 100 金霉素 Chlortetracycline 150 150 多西环素 Doxycycline 70 70 泰乐菌素 Tylosin 65 65 红霉素 Erythromycin 70 70 吡利霉素 Pirlimicin*80 80 替米考星 Tilmicosin 50 50 DB13/T 5143 2019 5 表1 方法检出限表（续）药物名称 英文名称 检出限(g/kg)肾脏、肝脏、肌肉、家禽血 清 家畜血清和尿液 拖拉霉素 Tulathromycin*400 400 螺旋霉素 Spiramycin 150 150 林可霉素 Lincomycin 50 50 庆大霉素 Gentamicin 50 50 链霉素 Streptomycin 400 400 双氢链霉素 Dihydrostreptomycin 400 400 卡那霉素 Kanamycin 70 70 新霉素 Neomycin 400 400 大观霉素 Spectinomycin 400 400 新生霉素 Novobiocin 1000 1000 杆菌肽（枯草杆菌素）Bacitracin 350 350 氯霉素 Chloramphenicol 0.1 0.1 氟苯尼考 Florfenicol 80 80 甲砜霉素 Thiamphenicol 40 40 喹乙醇 Olaquindox 2 2 DB13/T 5143 2019 6 附 录 A（资料 性附 录）KIS 检 测棒 示意 图 图A.1 KIS 检测 棒示 意图 DB13/T 5143 2019 7 附 录 B（资料 性附 录）结果判 读卡 示意 图 图B.1 结果 判读 卡示 意图