ICS 65.020.30 CCS B 42 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 4206 2020 渔用兽药 中草药 中氯霉素 的测定 液相色谱 串联质谱 法 Determination of chloramphenicol in fishery Chinese Traditional and Herbal Drugs by liquid chromatography tandem mass spectrometry 2020-11-10 发布 2020-12-10 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4206 2020 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由山 东省 农业 农村 厅提出 并组 织实 施。本文件 有山 东省 农业 标准 化委员 会渔 业标 准化 分技 术委员 会归 口（鲁TC/SC03）。本文件 起草 单位：山 东省 淡水渔 业研 究院、青 岛市 华测检 测技 术有 限公 司。本文件 主要 起草 人：吴蒙 蒙、姚 建华、朱 永安、武 风娟、孙栋、赵 华锋、张 婵、郭 芳芳、刘 红 彩。DB37/T 4206 2020 1 渔 用兽药 中草药 中氯霉 素的测定 液相 色谱串联 质谱法 1 范围 本文件 规定了 渔用 兽药 中 草药中 氯霉素 测定 的原理、试剂 和耗料、仪 器设备、样品、测定 步骤、测量结 果、检测 方法 灵敏 度、回 收率、精 密度、线 性范围。本文件 适用 于渔 用兽药 中 草药中 氯霉 素的 测定 方法。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中：注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法。3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 原理 样品在 碱性 条件 下经 过乙 酸乙酯 振荡 提取，提 取液 浓缩后 乙腈 复溶，经C18 固 相萃取 小柱、液 液 分 配净化后，液 相色 谱串 联质 谱仪测 定，内标 法定 量。5 试剂和 耗材 5.1 水：GB/T 6682，一 级。5.2 乙酸乙 酯：色谱 纯。5.3 乙腈：色谱 纯。5.4 甲醇：色谱 纯。5.5 氨水：分析 纯。5.6 50%乙 腈水 溶液：将50 mL 乙腈 与50 mL 水 混合 均匀。5.7 氯化钠：分 析纯。5.8 氯霉素 标准 品：氯霉 素 CAS56-75-7，纯度 不低 于 99.2%，于-18 储存，有 效 期 3 年。5.9 标准溶 液的 配置。a)氯霉素 标准 储备 液：称取 氯霉素 对照 品 10 mg(精确 至0.01 mg)于 10 mL 棕色 容量瓶 中，用 甲 醇(4.4)溶解 定容，该 溶液 浓 度为 1 mg/mL。-18 避 光 保存，有效 期 为6 个 月。b)氯霉素 标准 工作 液：准 确移取 氯霉 素标 准储 备 液0.1 mL 于 10 mL 棕色 容量 瓶中，用甲 醇稀 释定容，该溶 液浓 度 为 10 g/mL。-18 避 光保 存，有效期 为 3 个月。DB37/T 4206 2020 2 c)氯霉素 标准 工作 液：准 确移取 氯霉 素标 准工 作液 0.1 mL 于10 mL 棕 色容 量瓶中，用 甲 醇 稀释定容。该 溶液 浓度 为 0.1 g/mL。-18 避 光保 存，有效 期 为 3 个 月。d)氯霉素 氘代 内标：氯 霉 素D-5，纯度 不低 于99%，于-18 储存，有 效期3 年。e)氘代氯 霉素 储备 液：10 mg(精确至0.01 mg)于 10 mL 棕色容 量瓶 中，用甲 醇溶 解定容，该 溶 液浓度 为1 mg/mL。-18 避 光保存，有 效期为 6 个月。f)氘代氯 霉素 标准 工作 液：准确 移取 氘代 氯霉 素标 准储备 液 0.1 mL 于 10 mL 棕色容 量瓶 中，用甲醇稀 释定 容，该溶 液浓 度为 10 g/mL。-18 避 光保存，有 效期 为3 个月。g)氘代氯 霉素 标准 工作 液：准确 移取 氯霉 素标 准工 作液0.1 mL 于 10 mL 棕 色容量 瓶中，用 甲醇稀释 定容。该 溶液 浓度 为 0.1 g/mL。-18 避 光保存，有 效期 为3 个月。5.10 实验耗 材 5.10.1 C18 固相萃 取柱：1 000 mg/6 mL。5.10.2 微孔滤 膜：0.22 m，有 机系。6 仪器设 备 6.1 液相色 谱 串联 质谱 仪：配电喷 雾离 子源（ESI）。6.2 电子天 平：感 量0.000 1 g 和0.01 mg。6.3 旋涡混 合器。6.4 离心机：转 速不 低 于 10 000 r/min。6.5 固相萃 取装 置。6.6 超声波 震荡 器。6.7 旋转蒸 发仪。7 样品 从原始 样品 中取 出部 分有 代表性 样品，经高 速组 织 捣碎机 均匀 捣碎 或混 匀，为保证 样品 均一 性，全部过0.45 mm 筛，用四分法缩分出 适量试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后 作出标记，一份 作为试样，一 份作 为留 样。液体样 品混 匀后 取出 部分 作为试 样，其余 样品 作为 留样。8 测定步 骤 8.1 提取 称取2 g（精 确至0.001 g）样品于50 mL 离 心管，加入 氘代氯 霉 素 标准 工作 液40 L，加入8 mL水，混匀后 静置30 min，加入0.5 mL 氨水，再 加入30 mL 乙 酸乙酯，振 荡提 取10 min，10000 r/min 离心5 min，取上层 乙酸 乙酯 于鸡 心瓶 中，40 旋转 浓缩 至近 干，加入2 mL 乙腈 涡旋 混匀，取1 mL加入4 mL 水 混匀。8.2 净化 依次用6 mL 乙腈 和6 mL 水活化C18 固 相萃 取柱，加 载上 样液并 弃去，近 自然 滴干 时，再 加入15 mL 乙腈水，收 集洗 脱液 于50 mL 离 心管中，加 入约0.5 g氯 化 钠使上 述溶 液饱 和，振荡，4 500 r/min离心5 min，取上层 乙腈 层于40 氮 吹 浓缩至 干。准确 加入2 mL 乙腈溶 液定 容，过0.22 m滤膜。8.3 标准工 作曲 线的 制备 DB37/T 4206 2020 3 精确移 取适 量氯 霉素 标准 工作液 于10 mL 棕色 容量 瓶 中，各 加入 氘代 氯霉 素标 准工作 液0.1 mL，用乙腈 水溶液稀释 成浓度分别为0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、5.0 g/L 的标 准溶液，现用现 配，供液 相色 谱-串 级质谱 仪测 定，内标 法定 量。8.4 仪器测 定 8.4.1 液相色 谱条 件 色谱柱：BEH C18 柱，长50 mm，内 径2.1 mm，粒 径1.7 m，或性 能相 当者；柱 温：40；流速：0.3 mL/min；进样量：3 L；流动相：A：乙 腈；B：水，梯度 洗脱 条件 见表1。表1 梯度洗 脱程 序表 序号 时间 min 流速 mL/min A 的比例%B 的比例%1 0.00 0.3 10 90 2 1.50 0.3 95 5 3 3.50 0.3 95 5 4 3.51 0.3 10 90 5 5.00 0.3 10 90 8.4.2 质谱条 件 离子化 模式 及扫 描方 式：电喷雾 负离 子扫 描（ESI-）；检测方 式：多反 应检 测（MRM）；毛细管 电压（Capillary）：2.0 Kv；脱溶剂 温度（Desolvation Temperature）：400；脱溶剂 气流 速（Desolvation）：1000 L/Hr；锥孔气 流速（Cone）：150 L/hr；雾化气（Nebuliser）：7.0 Bar；定性离 子对、定 量离 子对 及电压、碰 撞能 量见 表2。表2 质谱参 数 名称 母离子 Parent m/z 子离子 Daughter m/z 锥孔电压 Cone V 碰撞能量 Collision Energy V 氯霉素 321.0 152.1 25 18 321.0 257.1 25 12 氯霉素-D5 326.1 157.1 25 18 8.4.3 定性测 定 在相同 测定条件下，待 测物在样 品中的保留时间 与标准工 作液中的保留时 间相对偏 差在2.5%之内，并 且色 谱图 中定 性离 子 对的相 对丰 度与 浓度 接近 的标准 工作 液中 相应 定性 离子对 的相 对丰 度进 行 比较，若 相对 偏差 不超 过表3 规定的 范围，则 可判 断为 样品中 存在 对应 的待 测物。DB37/T 4206 2020 4 表3 定性确 证时 相对 离子 丰度 的最大 允许 误差 相对离子丰度%50 2050 1020 10 允许的相对偏差%20 25 30 50 8.4.4 定量测 定 在仪器 正常 工作 条件 下，将标准 工作 溶液（从 低浓 度到高 浓度）和 试样 溶液 上机测 定，内标 法定 量。氯霉素 标准 工作 液特 征离 子的多 反应 监测（MRM）色 谱图见 附录A。8.5 空白测 试 除不加 试样 外，均按 上述 测定步 骤进 行。8.6 平行测 试 按照上 述前 处理 方式 对同 一样品 进行 平行 试验 测试。9 测量结 果 试样中 氯霉素 的含 量按公 式（1）计算，数值 以微 克 每千克（g/kg）表示，计算结 果需扣 除空 白值：c=VnXm.(1)式中：X 样 品中 氯霉 素的 含 量（g/kg）；c 从 内标 标准 曲线 查 得的试 样溶 液氯 霉素 的浓 度，单 位为 微克 每升（g/L）；V 试 样的 定容 体积，单位为 毫升（mL）；n 等 分倍 率；m 试 样的 质量，单 位 为克（g）。测定结 果用 平行 测定 算术 平均值 表示，结 果保 留2 位 有效数 字。10 检出限、回 收率、精 密度、线性 范围 10.1 检出限 与定 量限 本方法 检出 限为0.3 g/kg，定 量限 为1 g/kg。10.2 回收率 本方法 基质 加标 样品 加标 量1 g/kg 10 g/kg 范 围内，回收 率均 为80%120%。10.3 精密度 本方法 的批 内变 异系 数CV 小于等 于10%，批间 变异 系数CV 小于 等于15%。10.4 线性范 围 DB37/T 4206 2020 5 本方法 标准 曲线 线性 范围 为0.2 g/L 10 g/L。DB37/T 4206 2020 6 A A 附 录 A（资料 性）氯霉素 标准 溶液 谱图 图A.1 氯霉素 标准 溶液 色谱 图（浓度 为0.2 g/L）_