B22 张家口市地方标准 DB1307 DB1307/T 3002020“张杂谷”品种分 子鉴定技 术规程 2020-01-06 发布 2020-01-21 实施 张家口市 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB1307/T 3002020 前 言 本标准 按 照 GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由张 家口 市农 业科 学院提 出。本标准 起草 单位：张 家口 市农业 科学 院、北京 市农 林科学 院、河北 巡天 农业 科技有 限公 司。本标准 主要 起草 人：赵治 海、魏玮、李双 东、范光 宇、王 凤格、赵 久然、易 红梅、王蕊、叶 世峰、李素军、朱 成平、刘粤 阳、杨建 勇、赵芳、张 晓磊、冯小磊、王 晓明、王峰、史高雷、宋 国亮、王德 权、张雅莉、李 欣儒、张 文英、邱风 仓、裴晶 晶。DB1307/T 3002020 1“张杂谷”品种分 子鉴定 技术规程 1 范围 本标准 规定 了 采 用微 卫星 标记进行“张杂 谷”品种 分子鉴 定 的 术语 和定 义、原理、仪器 设备、试剂及溶液 配制、引 物信 息、参照品 种信 息、操作 程序、数据 记录 与统 计、判定 规则 等 技术 要求。本标准 适用 于“张杂 谷”品种分 子鉴 定。2 术语 和定 义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 核心引 物 品种鉴 定 中 优先 选用 的一 套 SSR（simple sequence repeat）引物，具有 多态 性高、重复 性好 等特点。2.2 参照品 种 所用 的 SSR 标 记能 够扩 增 出稳定、清 晰、可辨 的等 位变异 的品 种。参照 品种 用于 辅 助确 定待 测样品的等 位变 异，校正 实验 操作、仪器 设备 的系 统误 差。3 原理 由于不 同 谷子 品种 遗传组 成不同，基因 组DNA 中简 单 重复序 列的重 复次 数 存在 差异，利用微 卫星 标记技术 可鉴定 不同 谷子 品种 及来 源。4 仪器 设备 仪器设 备 见 附录A。5 试剂 及 溶 液配 制 试剂及 溶液 配制 见附 录B。6 引物 信息 引物信 息 核 心引 物名 单及 序列 表 见附 录C，核 心引 物 等位变 异等 相关 信息 见附 录D。7 参照 品种 信息 参照品 种信 息 见 附录E。DB1307/T 3002020 2 8 操作 程序 8.1 取样 送验样 品 可为 种子、幼苗、叶片、果穗 等 组 织或器 官。对 谷子材料 随 机数取 至少5个 个体 组成混合样品进 行分 析。8.2 DNA 提取 8.2.1 CTAB 提 取法：幼苗 或叶片 约 200 mg 300 mg，置 于 2.0 mL 离心管，加 液氮冷冻，充 分研 磨，或取种子 充分 磨碎，移入 2.0 mL 离心管；每 管加 入 700 L 65 预 热的 CTAB 提 取液后，充分 混合，65 保温 60 min，期间 多次 颠 倒混匀；每管 加入 等体 积的 三氯甲 烷/异 戊醇 混合 液，充分混 合后，静置 10 min；12 000 rpm 离心 15 min，取上清 液，加入 等体 积预 冷的异 丙醇，颠 倒离 心管 数次，-20 放置 30 min；4，12 000 rpm 离心 10 min，弃上清液；加 入 70%乙醇，旋转 离 心 管数 次，弃去乙 醇；将离 心管 倒立于垫有 滤纸 的实 验台 上，室温干 燥沉 淀 6 h 以 上；加入 100 L 超纯水或 TE 缓冲液，充 分溶 解后 备用。8.2.2 也可 使用 其它 达到 PCR 扩增 质量 要求 的 DNA 提取方 法。8.3 PCR 扩增 8.3.1 引物 选择 首先选 择附录C 中 第118 对引物 进行 检测，当样 品 间检测 出的 差异 位点 数小 于2时，再选 用附 录C 中第1936 对引 物 进 行检 测。8.3.2 反应 体系 各组分 的 终 浓度 如下：每种dNTP 0.10 mmol/L，上游、下 游 引 物各0.24 mol/L，Taq DNA 聚合 酶0.04 U/l，1 倍PCR 缓 冲液（含Mg2+2.5 mmol/L），DNA 浓度2.5ng/l，其 余以 超纯 水补足 至所 需体 积。8.3.3 反应 程序 94 预变 性5 min，1 个循 环；94 变性40 s，60 退火35 s，72 延伸45 s，共35个 循环；72 延伸10 min，4 保存。8.4 PCR 产 物检 测 8.4.1 变性 聚丙 烯酰 胺凝 胶电泳（PAGE）法 8.4.1.1 清 洗玻 璃板 用清水 沾洗 涤灵 将玻 璃板 反复擦 洗干 净，双 蒸水 擦 洗两遍，95%乙 醇擦 洗两 遍，干燥。在 长板 上涂上0.5 mL 亲和硅烷工 作液，带 凹槽 的 短 板上涂0.5 mL 剥离硅烷工 作液。操 作 过程中 防止 两块 玻璃 板互相污染。8.4.1.2 灌胶 在100 mL 4.5%PAGE 胶中 加入TEMED 和25%过 硫酸 铵各100 L，迅 速 混匀 后 灌胶。待胶 流动 到下部，在 上部 轻轻 的插 入梳 子，使 其聚 合1h 以上。灌 胶时应 匀速 防止 出现 气泡。8.4.1.3 预 电泳 在正极 槽（下 槽）中 加入1 倍TBE 缓冲 液600 mL，在负极槽（上槽）加入 预热 至65 的1 倍TBE 缓冲液600 mL，拔出梳子。90W 恒功 率预 电泳1020 min。DB1307/T 3002020 3 8.4.1.4 变性 在20 L PCR产物 中 加入4 L 6倍加样缓冲 液，混匀 后，在PCR 仪 上运 行变 性程 序：95 变性5 min，4 冷却10 min 以上。8.4.1.5 电泳 用移液 器吹 吸加 样槽，清 除气泡 和杂 质，插入 样品 梳子。每一 个加 样孔 点 入 5 l 样 品。80W 恒功率电泳 至上 部的 指示 带（二甲苯 青 FF）到达胶板 的 中部。电泳 结束 后，分开 两块玻 璃板。注：预期扩增产物片段大小在150 bp 以下时电泳时间应适当缩短，扩增产物片段大小在300 bp 以上时电泳时间应 适当延长。8.4.1.6 银染 银染按 以下 步骤 进行：a）固 定：固定 液中 轻轻 晃 动 3 min；b）漂 洗：双蒸 水快 速漂 洗 1 次，不 超 过 10 s；c）染 色：染色 液中 染色 5 min；d）漂 洗：双蒸 水快 速漂 洗，时间 不超 过 10 s；e）显 影：显影 液中 轻轻 晃 动至带 纹出 现；f）定影：固 定液 中定 影 5 min；g）漂 洗：双蒸 水漂 洗1 min。8.4.2 荧光 标记 毛细 管电 泳 8.4.2.1 样 品制 备 等体积混合 不同荧 光SSR 标记（FAM，ROX）扩增 产物，混匀后从混 合液中 吸取1 L 加入到DNA分析仪 专用96孔 板孔 中。板中各 孔分 别加 入0.1 L 分子量 内标 和8.9 L 去离子甲酰 胺。将样 品 在PCR 仪上95 变性5 min，取出，立即置 于碎 冰上，冷 却10 min 以上。离心10 s 后 置放 到DNA 分 析仪 上。8.4.2.2 电 泳检 测 按照仪 器操 作手 册，编辑 样品表，执 行运 行程 序，保存数 据。9 数据 记录 与统 计 9.1 数 据记 录 对普通 变性 聚丙 烯酰 胺凝 胶电泳，将 每个 扩增 位点 的 等位变 异与 参照 品种 的等 位变异 片段 大小 进行比较，确 定样 品在 该位 点 的等位 变异；对荧 光标 记 毛细管 电泳，通过 参照 品 种消除 同型 号不 同批 次间 或不同型 号 DNA 分 析仪 间可 能存在 的系 统误 差，使用 片段分 析软 件读 取样 品在 该位点 的等 位变 异。纯合位 点的 基因 型数 据记 录为 X/X，杂 合位 点的 基 因型数 据记 录 为 X/Y，其 中 X、Y 分 别为 该位 点上两个 等位 变异，小 片段 数据在 前，大片 段数 据在 后；缺 失位 点基 因型 数据 记录 为 0/0。示例 1：样品在某个位点上仅 出现一个等位变异，为 150，在该位点的基因型记录为 150/150；示例2：样品在某个位点上有两 个等位变异，分别为150、160，在该位点的基因型记录为150/160。9.2 数 据统 计 当对送 验样 品混 合 DNA 进 行分析 时，可 直接 进行 品 种间成 对比 较，如 果样 品 某个引 物位 点出 现可DB1307/T 3002020 4 见的异 质性 且影 响到 差异 位点判 定时，可 重新 提取 至少 20 个 个体 的 DNA，并用该 引物 重新 扩增，统 计在该引 物位 点上 不同 个体 的基因 型（或 等位 变异）及所占 比例。当对 送检 样 品多个 个 体 DNA 进行 分析时，应 统计 其在 各引 物位 点的各 种基 因型（或 等位 变异）及所 占比 例。对单 交种，应比 较两 个样 品 在 各引物位 点的 基因 型；对自 交系，应比 较两 个样 品在 各引物 位点 的等 位变 异。成对比 较的 数据 统计 记录 表见附 录F。10 判 定规 则 10.1 结果 判定 当样品 间差 异位 点数 2，判定为“不同”；当 样品 间差异 位点 数1，判定 为“近似”；当样 品间差异位 点数 0，判 定为“极近似 或相 同”。对利用 附录C 中36 对引 物仍 未检测 到2 个差 异位 点数 的样品，如果 相关 品种 存 在特定 标记，必要 时增加其 特定 标记 进行 检测。10.2 结果 表述 比较位 点数：，比 较位点 为：；差 异位点 数：，差 异 位点为：；判定为：。DB1307/T 3002020 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）主要仪 器设 备及 试剂 A.1 主要仪 器设 备 A.1.1 PCR扩 增仪 A.1.2 高压电 泳仪 规格为3000V、400mA、400W，具有 恒电 压、恒电 流和恒 功率 功能。A.1.3 垂直电 泳槽 及配 套的 制胶 附件 A.1.4 普通电 泳仪 A.1.5 水平电 泳槽 及配 套的 制胶 附件 A.1.6 高速冷 冻离 心机 最大离 心力 不小 于15 000 rpm，-10 30。A.1.7 水平摇 床 A.1.8 胶片观 察灯 A.1.9 电子天 平 感应为0.01 g、0.001 g。A.1.10 微量移 液器 规格分 别为10 L、20 L、100 L、200 L、1000 L，连续可 调。A.1.11 磁力搅 拌器 A.1.12 紫外分 光光 度计 波长260 nm 及280 nm。A.1.13 微波炉 A.1.14 高压灭 菌锅 A.1.15 酸度计 A.1.16 水浴锅 或金 属浴 控温精 度1。A.1.17 冰箱 最低温 度-20。DB1307/T 3002020 6 A.1.18 制冰机 A.1.19 凝胶成 像系 统或 紫外 透射 仪 A.1.20 DNA分 析仪 基于毛 细管 电泳，有 片段 分析功 能和 数据 分析 软件，能够 分辨1个 核苷 酸大 小 的差异。DB1307/T 3002020 7 B B 附 录 B（规范 性附 录）溶液配 制 B.1 主要试 剂 B.1.1 十六烷 基三 乙基 溴化 铵（CTAB）B.1.2 三氯甲 烷 B.1.3 异丙醇 B.1.4 异戊醇 B.1.5 乙二胺 四乙 酸二 钠（EDTA-Na22H2O）B.1.6 三羟甲 基氨 基甲 烷（Tris-base）B.1.7 盐酸（HCI）：37%B.1.8 氢氧化 钠（NaOH）B.1.9 氯化钠(NaCl)B.1.10 10倍 PCR Buffer 缓 冲液 含Mg2+25 mmol/L B.1.11 四种脱 氧核 苷三 磷酸 dATP、dTTP、dGTP、dCTP（每种10 mmol/L）B.1.12 Taq DNA 聚 合酶 B.1.13 矿物油 B.1.14 琼脂糖 B.1.15 DNA分 子量 标准 B.1.16 核酸染 色剂 B.1.17 去离子 甲酰 胺 B.1.18 溴酚蓝 B.1.19 二甲苯 青FF B.1.20 甲叉双 丙烯 酰胺 B.1.21 丙烯酰 胺 B.1.22 硼酸 DB1307/T 3002020 8 B.1.23 尿素 B.1.24 亲和硅 烷 B.1.25 剥离硅 烷 B.1.26 无水乙 醇 B.1.27 四甲基 乙二 胺 B.1.28 过硫酸 铵 B.1.29 冰醋酸 B.1.30 乙酸铵 B.1.31 硝酸银 B.1.32 甲醛 B.1.33 DNA分 析仪 专用 丙烯 酰胺 胶 液 B.1.34 DNA分 析仪 专用 分子 量内 标Liz标记 B.1.35 DNA分 析仪 专用 电泳 缓冲 液 B.2 DNA 提 取溶 液的 配制 B.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液 称取186.1 g Na 2EDTA.2H 2O溶于800 mL 水中，加 固体 氢氧 化钠 调pH 值至8.0，定容至1000 mL，高压灭菌。B.2.2 1 mol/L Tris-HCl溶液 称取60.55 g Tris 碱 溶于 水 中，加HCl 调pH 至8.0，定 容至500 mL，高压灭 菌。B.2.3 0.5 mol/L 盐酸 溶液 量取25 mL 浓盐酸，加水 定 容至500 mL。B.2.4 CTAB提 取液 称取81.7g 氯化 钠和 20g CTAB 溶 于适 量水 中，加入1 mol/L Tris-HCl 100 mL，0.5 mol/L EDTA 40 mL，定容至1000 mL，4 贮存。B.2.5 TE缓冲 液 量取1 mol/L Tris-HCl 5mL，0.5 mol/L EDTA 1mL，加 盐酸 调pH 至8.0，定 容至500 mL。B.2.6 5 mol/L 氯 化钠 溶液 称取146 g 固体 氯化 钠 溶 于水中，定 容至500 mL。B.3 PCR 扩 增溶 液的 配制 DB1307/T 3002020 9 B.3.1 dNTP 量取 超 纯水 分别 配制dATP、dTTP、dCTP、dGPT 终 浓度100 mmol/L 的储存液，各取20 L 混合，加超纯水720 L 定容至 每种 终浓度2.5 mmol/L 工作液。B.3.2 SSR引物 量取 超 纯水 分别 配制 上游 引物和 下游 引物 终浓 度均40 mol/L 的储存液，等体 积混合 成20 mol/L 工作液。注：干粉配制前应首先快速离 心。B.3.3 6倍加 样缓 冲液 量取 去 离子 甲酰 胺49 mL，0.5 mol/L 的EDTA 溶液（pH8.0）1 mL，加溴酚兰0.125 g，二 甲苯 青0.125 g。B.4 变性聚 丙烯 酰胺 凝胶 电泳 溶液的 配制 B.4.1 40PAGE 胶 称取 丙 烯酰 胺190 g 和 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 10 g，定 容 至 500 mL。B.4.2 4.5%PAGE 胶 称取尿素450 g，量取10 倍TBE 缓 冲液100 mL，40%PAGE 胶112.5 mL，定容至1000 mL。B.4.3 Bind缓 冲液 量取49.75 mL 无水乙醇，250 L 冰醋酸，混匀。B.4.4 亲和硅 烷工 作液 量取1 mL Bind 缓冲液，加入5 L Bind 原液，混 匀。B.4.5 剥离硅 烷工 作液 2%二 甲基 二氯 硅烷。B.4.6 25%过 硫酸 铵溶 液 称取0.25 g 过硫 酸铵 溶于1 mL 超纯水。B.4.7 10倍TBE 缓 冲液 称取Tris 碱108 g，硼酸 55 g，量取0.5 mol/L EDTA溶液37 mL，定容至1000 mL。B.4.8 1倍TBE 缓冲 液 量取10 倍TBE 缓 冲液500 mL，加水定容 至5000 mL。B.5 银染溶 液的 配制 B.5.1 固定液 量取100 mL 冰醋酸，加水 定容至1000 mL。DB1307/T 3002020 10 B.5.2 染色液 称取2 g 硝 酸银，加 水定 容 至1000 mL。B.5.3 显影液 1000 mL 蒸 馏 水 中 加 入 30 g 氢 氧 化 钠 和 5 mL甲醛。C DB1307/T 3002020 11 附 录 C（规范 性附 录）核心引 物名 单及 序列 表 表C.1 规定 了核 心引 物 名 称及序 列。表C.1 核心 引物 名单 及序 列 表 编号 引物名称 引物序列 P01 MI 32 上游：GGTAACCAACCAGCGCATTGC 下游：GCGTTCTCGAACTTGCACTCTC P02 MI 34 上游：GCGGCGGGAATGGTTGATG 下游：GAAGCCGTGGCACCAAAGC P03 MI 35 上游：AGCTGCAACCTGTCTTGAGAGC 下游：GCAGAAGTGGCCGCGACAG P04 MI 28 上游：TCCTCCTACACGGGCAGACC 下游：AGCTCGGGGCAGCGATAAAC P05 MI 40 上游：CAGGCTCTGCCGAGGAACG 下游：CACGCGGTGGCAAAAGAACTC P06 MI 50 上游：GCAAGTCGGATGCGATAGCC 下游：CGTGGGTGGGCATCTATGATCG P07 MI 36 上游：GAACGCTGAACCCTACCCTCTC 下游：AGGTCTGGGCTACGGGCTAC P08 MI 10 上游：CTCGCGTATATGGCTCCAAGTG 下游：GAGTCGCCGTCGCATGGTC P09 MI 47 上游：AACGCCAACTCACCAACACAAG 下游：AGGAGCAAGACGTGGAGCATG P10 MI 54 上游：CGACTGGGTCTCTAGCCACCAC 下游：CCTTGCCACCCTTCGGACTAAC P11 MI 03 上游：TCGGATGGGCAGACGAGAGG 下游：CACACACCGCCAAGGCAAAG P12 MI 02 上游：GCTCAGCGCCCAGTTCGAC 下游：AAAGAAGAGCGGTTTGCGTGAC P13 MI 63 上游：AAGAAGAGCGGAGTAGCTTGCG 下游：TCAGACACACTGGGCCTAATGC P14 MI 37 上游：TTCCTGCCGCGCTTTCTCG 下游：CGGAGAATTACTGCCCGAGGAG P15 MI 31 上游：CCTGCCCTCTGTCCCTGTATTC 下游：TTTAGGAGGCGGCATTTTGGTG P16 MI 27 上游：ACAACGCATGGACTGTGATCG 下游：TGTTGTACTGCAACGCCGAAAG P17 MI 18 上游：CCGTCGTGGGAAGCAGTGC 下游：AGACTCGGTTTCGCCAATTTGC P18 MI 61 上游：ACTGGACTGTAAGCACAAGTGC 下游：CTTTGACAGTTCAGGCGGGTTG P19 MI 12 上游：GCCGCGCAAACCCCTAAAC 下游：CGGGGAAGTCGAGCACCTC P20 MI 44 上游：CGAAAGCACAGGTACCCTTGTC 下游：CAGCCCCTCCGTCTTTGCC DB1307/T 3002020 12 表 C.1 核 心引 物名 单及 序 列表（续）编号 引物名称 引物序列 P21 MI 38 上游：GCGCAACATAGTCCCGAAAATG 下游：TACCTGGACATCCCTGCTCTCG P22 MI 06 上游：GGTGGGCGGAATCCTGATGAAC 下游：TTCACCCCGGCATAAGTTCAGG P23 MI 59 上游：CGGCAAGCGTGGTGTCCTAG 下游：ACTCTGGCGAGGAAAGGATGC P24 MI 14 上游：CACTGCGAGTATTGCGTGTGC 下游：TTGCTCATGGAAACGGTCACTG P25 MI 25 上游：CGATCATCCCGTTCCTTGCATG 下游：CAAGAGCCCAGAGGTCCTGTAC P26 MI 20 上游：AACCAATGCGGCTGCAAACG 下游：TTGGGTTCGGTCCGCTCATTC P27 MI 62 上游：TCGCCCCGTCCATTTCGTG 下游：CGAATTCCTGCGAGCTGACATG P28 MI 07 上游：GGTGTGCTGGTGAACGCATAGG 下游：TCGGTCGCGTGTTGGCTTG P29 MI 19 上游：GCTGTCATGTCGATCTGATGGC 下游：GGCCAATTGCGATTCGTCCAG P30 MI 41 上游：CCACTCTGCAACCCACTCTCC 下游：CCAGAATGGGCCGCTCACC P31 MI 42 上游：ACGTCAAGGCTTCCGTCTGTC 下游：CCGCCACAGCGCGTTAATTAG P32 MI 04 上游：TCAGAGCCCGAATCATCGCTAC 下游：ACTCTAGGGAGGGAGCCTTCTC P33 MI 08 上游：GTTTGCCGGTATGTGACGTTGC 下游：GCTCGCAGCATCCGAAGGTG P34 MI 17 上游：CAGTCGGATGGGTCGCTGTC 下游：TCCAATGGAGACCACGGCAATC P35 MI 22 上游：CGACATCAGACGGGGATTGGG 下游：TCAGCTCGTTACATTGGTTGCG P36 MI 57 上游：GGAATGTTGCCCTGTGCTTGAG 下游：GCCACCCACATCCTTTGCAG D DB1307/T 3002020 13 附 录 D（资料 性附 录）核心引 物 扩 增产 物 相 关信 息 表D.1 规定 了核 心引 物扩 增产物 相关 信息。表D.1 核心 引物 扩增 产物 相关信 息 表 引物编号 引物名称 等位变异范围(bp)等位变异(bp)参照品种名称 参照品种基因型 P01 MI 32 273-293 273 小黄谷 273/285 279 张杂谷 3 号 279/285 282 蒜皮白 282/285 285 农大 8 号 285/293 288 124 父本 279/288 290 洋谷子 273/290 293 晋谷29 号 293/293 P02 MI 34 178-189 178 金香玉 178/186 179 A2 179/179 184 盖叶红 184/186 185 坝谷 257 185/187 186 南二沙 186/188 187 晋谷40 号 179/187 188 大金苗 178/188 189 蒜皮白 179/189 P03 MI 35 262-294 262 张杂谷16 号 262/285 268 ISE375 268/268 271 张杂谷12 号 271/285 274 八斗子 274/291 277 齐头黄 277/277 279 张杂谷10 号 279/285 283 A52 271/283 285 张杂谷19 号 285/291 288 124 父本 288/288 291 大同29 291/291 294 豫谷18 294/294 P04 MI 28 235-257 235 金香玉 235/235 236 张杂谷20 号 236/237 237 张杂谷19 号 237/238 238 DH3 238/238 243 小乌谷子 243/243 256 ISE375 256/256 257 张杂谷12 号 237/257 P05 MI 40 202-212 202 坝谷 257 202/206 DB1307/T 3002020 14 表D.1 核 心引 物 扩 增产 物 相关信 息 表（续）203 花脸 203/203 206 DH2 206/206 209 陇谷11 号 209/209 210 张杂谷16 号父本 210/210 212 小鸡了 212/212 P06 MI 50 270-276 270 ISE120 270/270 272 长杂 2 号 272/274 274 张杂谷22 号 274/276 276 A2 276/276 P07 MI 36 246-253 246 张杂谷 6 号 246/252 247 18 沙619 247/247 252 张杂谷16 号父本 252/252 253 Y117 253/253 P08 MI 10 162-176 162 压破车 162/166 166 齐头黄 166/173 169 ISE1541 169/169 173 毛毛谷 173/173 176 蒜皮白 166/176 P09 MI 47 253-287 253 冀谷41 253/253 263 张杂谷 6 号 263/271 265 8311 265/265 267 张杂谷 3 号 267/271 269 大金苗 269/277 271 张杂谷 19 号 271/281 273 花脸 273/273 275 会宁凉谷 275/275 277 豫谷18 277/277 279 龙爪谷 279/279 281 DH2 281/281 283 ISE120 283/283 285 金香玉 285/285 287 南二沙 253/287 P10 MI 54 274-292 272 ISE1541 272/284 274 124 父本 274/274 278 洋谷子 278/288 282 ISE120 182/282 284 张杂谷10 号 284/288 286 张杂谷 3 号 286/288 287 齐01 287/287 288 大金苗 288/290 DB1307/T 3002020 15 表D.1 核 心引 物 扩 增产 物 相关信 息 表（续）290 冀谷41 290/290 292 张杂谷22 号父本 292/292 294 3422 294/294 P11 MI 03 156-162 156 济谷19 号 156/162 159 ISE1541 159/162 162 张杂谷20 号父本 162/162 P12 MI 02 161-172 161 农大 8 号 161/164 164 张杂谷18 号 164/167 167 张杂谷13 号 167/170 170 张杂谷22 号父本 170/170 172 张杂谷19 号 167/172 P13 MI 63 250-261 250 A2 250/250 251 承11-272 251/251 252 18 沙720 252/252 253 张杂谷10 号 250/253 261 张杂谷 6 号 250/261 P14 MI 37 199-213 199 蒙龙香谷 2 号 199/199 200 长杂 2 号 200/200 201 张杂谷22 号 201/213 213 8311 213/213 P15 MI 31 220-284 220 张杂谷12 号 220/235 235 农大 8 号 235/237 237 鸟不叼毛谷 220/237 239 毛毛谷 239/239 242 六十天还仓 242/242 244 老头谷 244/244 247 会宁凉谷 247/247 253 大金苗 253/253 255 小鸡了 255/255 260 大粒黄 260/260 265 张杂谷22 号父本 220/265 272 18JX2410 272/272 273 陇谷11 号 273/275 275 黑谷 275/275 281 蒙龙金谷 255/281 284 大同29 284/284 P16 MI 27 229-245 229 盖叶红 229/233 233 大金苗 233/238 234 ISE120 234/234 237 张杂谷 3 号 233/237 DB1307/T 3002020 16 表D.1 核 心引 物 扩 增产 物 相关信 息 表（续）238 大粒黄 238/238 245 乌谷 245/245 P17 MI 18 161-230 161 ISE1541 161/161 163 张杂谷22 号父本 163/163 167 盖叶红 167/169 169 A2 169/169 184 红苗 184/184 204 2176 204/211 205 藁城谷 205/205 209 湘西糯 209/209 211 2176 204/211 228 124 父本 169/228 230 18JX4210 169/230 P18 MI 61 180-202 180 张杂谷22 号父本 180/200 198 承11-272 198/198 200 张杂谷16 号父本 200/200 202 小青谷 202/202 P19 MI 12 199-204 199 盖叶红 199/202 200 张杂谷 6 号 200/203 202 ISE120 202/202 203 A2 203/203 204 晋红 102 204/204 P20 MI 44 238-242 238 红苗小白粒 238/238 239 张杂谷 3 号 239/242 241 18 沙619 241/241 242 A2 242/242 P21 MI 38 175-185 175 张杂谷10 号 175/178 176 ISE1541 176/181 178 晋谷29 号 178/180 179 小急谷 179/179 180 豫谷18 180/180 181 张杂谷 6 号 175/181 185 ISE120 185/185 P22 MI 06 218-224 218 A2 218/218 224 豫谷18 224/224 P23 MI 59 198-210 198 张杂谷20 号 198/207 207 张杂谷 3 号 207/210 210 DH2 210/210 P24 MI 14 205-221 205 蒙龙金谷 205/205 206 A2 206/206 DB1307/T 3002020 17 表D.1 核 心引 物 扩 增产 物 相关信 息 表（续）207 ISE375 207/207 210 张杂谷24 号父本 210/210 211 灰谷 211/213 212 张杂谷10 号 212/212 213 大青苗 213/213 214 鲁谷10 号 214/214 215 龙爪谷 215/215 218 DH2 218/218 219 金点玉 219/219 221 老绳头 221/221 P25 MI 25 236-244 236 毛毛谷 236/236 237 张杂谷18 号 237/238 238 豫谷18 238/238 239 张杂谷22 号 239/239 240 老绳头 240/240 242 花脸 242/242 244 盖叶红 244/244 P26 MI 20 198-215 198 张杂谷12 号 198/207 201 大头蝇 201/201 204 盖叶红 204/207 205 张杂谷16 号 205/207 207 A2 207/207 209 大青苗 209/209 212 陇谷11 号 212/212 215 ISE120 215/215 P27 MI 62 232-234 232 张杂谷 3 号 232/234 234 张杂谷20 号父本 234/234 P28 MI 07 171-178 171 张杂谷10 号 176/197 178 A2 178/178 P29 MI 19 285-329 285 大金苗 285/325 325 张杂谷18 号 325/329 326 张杂谷10 号 326/329 329 张杂谷 3 号 285/329 P30 MI 41 179-195 179 张杂谷12 号 179/191 181 ISE1541 181/192 188 鸟不叼毛谷 188/188 191 A2 191/191 192 小青谷 192/195 193 黑谷 179/193 195 刀把齐 195/195 DB1307/T 3002020 18 表D.1 核 心引 物 扩 增产 物 相关信 息 表（续）P31 MI 42 273-276 273 A2 273/273 276 ISE375 273/276 P32 MI 04 233-237 233 ISE1541 233/237 234 张杂谷10 号 234/237 237 A2 237/237 P33 MI 08 187-197 187 蒜皮白 187/192 192 张杂谷 6 号 192/197 196 小黄谷 196/196 197 大金苗 187/197 P34 MI 17 220-229 220 张杂谷10 号 220/225 225 张杂谷22 号父本 225/225 229 大同29 229/229 P35 MI 22 152-162 152 鸟不叼毛谷 152/162 159 ISE1541 159/166 162 张杂谷19 号 159/162 163 湘西糯 163/163 166 124 父本 166/166 P36 MI 57 242-252 242 蒙龙香谷 2 号 242/242 243 长杂 2 号 243/243 244 张杂谷12 号 244/252 252 DH2 252/252 注 1：附录 D 中提供的等位变 异包括了至今在审定和品 种权保护已知品种中检测到的所有等位变异，今后对于附录D 中未包括的等位变异，应按 本标准方法，确定其大小和对应参照品种后再补充发布。注 2：每个引物位点上提供的 参照品种包含了该位点最大、最小和 等位基因频率大于 0.05 的等 位变异，且每间隔一个等位变异至少提供一个参照品种。逐位点进行电泳检测时可从中选择使用部分或全部参照品种。DB1307/T 3002020 19 附 录 E（资料 性附 录）参照品 种名 单及 来源 表E.1 规定 了 参 照品 种名 单及来 源。表E.1 参照 品种 名单 及来 源 编号 品种名称 分组 编号 品种名称 分组 R01 A2 核心 R21 8311 扩展 R02 张杂谷 3 号 核心 R22 湘西糯 扩展 R03 张杂谷 6 号 核心 R23 豫谷18 扩展 R04 张杂谷10 号 核心 R24 大同29 扩展 R05 张杂谷12 号 核心 R25 冀谷41 扩展 R06 张杂谷13 号 核心 R26 长杂 2 号 扩展 R07 张杂谷16 号 核心 R27 坝谷 257 扩展 R08 张杂谷18 号 核心 R28 晋谷29 号 扩展 R09 张杂谷19 号 核心 R29 晋谷40 号 扩展 R10 张杂谷20 号 核心 R30 陇谷11 号 扩展 R11 张杂谷22 号 核心 R31 济谷19 号 扩展 R12 张杂谷24 号 核心 R32 齐01 扩展 R13 124 父本 核心 R33 花脸 扩展 R14 DH2 核心 R34 盖叶红 扩展 R15 DH3 核心 R35 金香玉 扩展 R16 ISE120 核心 R36 洋谷子 扩展 R17 ISE375 核心 R37 毛毛谷 扩展 R18 ISE1541 核心 R38 龙爪谷 扩展 R19 蒜皮白 核心 R39 齐头黄 扩展 R20 大金苗 核心 R40 南二沙 扩展 注1：同一名称不同来源的参照 品种在某一位点上的等位变异可能不相同，如果使用了同名的其它来源的参照品种，应与原参照品种核对，确认无误后使用。注2：多个 品种 在某一SSR 位 点上 可 能具 有相 同的 等位 变异，在 确 认这 些品 种该 位点 等位 变异 大 小与 参照 品种 相 同后，这些品种也可以代替附录