ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 3128.2 2020 群禽腺 病毒感染 诊断技术 第2 部分：血清4 型群禽腺病 毒感染 PCR 和荧光定量PCR 诊断技术 Diagnostic techniques for fowl adenovirus group I Part 2:Detection method on fowl adenovirus group I serotype 4 by PCR and quantitative real-time PCR 2020-06-08 发布 2020-07-08 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3128.2 2020 I 前 言 GB/T 1.1 2009 DB37/T 3128.2 2020 1 群禽腺 病毒感染 诊断技 术 第2 部 分：血 清 4 型 群禽 腺病毒感染 PCR 和 荧光定量 PCR 诊 断技术 1 范围 4 PCR PCR qPCR 4 PCR PCR 4 4 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 GB/T 27401 3 术语和 定义 3.1 血清4 型 群禽 腺病 毒 Fowl adenovirus group I Serotype 4-3 5 3.2 实时荧 光定 量PCR Quantitative Real-time PCR（qPCR）PCR 4 实验室 要求 4.1 环境 4.1.1 GB19489 GB/T 27401 BSL-2 DB37/T 3128.2 2020 2 4.1.2 PCR 4.1.3 4.2 人员 PCR qPCR 4.3 仪器设 备 4.3.1 4.3.2 PCR 0.3 4.3.3 15000 rpm 4.3.4 4.3.5 4.3.6 4.3.7 2 8 4.3.8-20 4.3.9 10 L 20 L 100 L 1000 L 4.3.10 0.001 g 4.3.11 4.3.12 PCR 4.4 试剂或 材料 GB/T 6682 4.4.1 DNA 4.4.2 rTaq DNA 5U/L 4.4.3 10 PCR 4.4.4 dNTPs 2.5 mmol/L,10 mmol/L 4.4.5 PCR 4.4.6 1.5%A.1 4.4.7 1 TAE A.2 4.4.8 10 g/L A.3 4.4.9 A.4 4.4.10 DNA 100 bp 2000 bp 5 4.4.11 4 SPF 4.4.12 DB37/T 3128.2 2020 3 4.4.13 PCR 检 测所 需引 物：上游引 物F：5-CTCTTCGACCTCGTGTCTTACA-3；下游引 物R：5-TTTACACGGCGTTGCCTGT-3，扩增 片段 长度 为 568bp，引 物浓 度 为100 mol/L。4.4.14 荧光定 量PCR 检 测所 需引 物：上游引 物1983F：5-CGTCAACTTCAAGTACTC-3；下游引 物2068R：5-AGAGGATGCTCATGTTAC-3；探针 P：5 FAM-CCTACTCAGATGGAGGCTTCTACC-TAMRA3，扩 增片段 长度 为 86bp，引物 浓度为100 mol/L。5 样品 5.1 样品采 集与 运输 4 4 24 h 5.2 样品保 存 5.2.1 pH 7.0 7.4 PBS A.5 5.2.2 2000 IU/mL 2 mg/mL 50 g/mL 1000 IU/mL pH 7.0 7.4 5.2.3 1 h 2 h 4 24 h 5.2.4-20 2 wk-70 30 d 5.3 样品处 理 5.3.1 10 g 20 g 5.3.2 200 L 2000 IU/mL 2 mg/mL 50 g/mL 1000 IU/mL pH 7.0 7.4 5.3.3 2000 IU/mL 2 mg/mL 50 g/mL 1000 IU/mL pH 值7.07.4 PBS 10%20%g/mL 8000 r/min 10 min 5.4 对照设 置 5.5 DNA 提取 DNA DNA DNA-70 5.6 PCR 反应 5.6.1 PCR 的 反应 体系 DB37/T 3128.2 2020 4 10 PCR Buffer 2.5 L,dNTPs 2.5 mmol/L 2 L F 100 mol/L R 100 mol/L 0.5 L DNA 3 L rTaq DNA 0.25 L 25 L 5.6.2 PCR 反 应条 件 94 5 min 94 30 s 53 30 s 72 30 s 30 72 10 min 5.6.3 琼脂糖 凝胶 电泳 PCR 9 L 1 L 1.0%DNA 5 V/cm 30 min PCR 5.7 实时荧 光定 量PCR 反应 5.7.1 实时荧 光定 量PCR 反 应体 系 Premix Ex Taq(Probe qPCR)10 L Rox Reference Dye II 0.2 L 1983F 100 mol/L 2068R 100 mol/L 0.4 L P 100 mol/L 0.4 L DNA 2 L ddH2O 20 L ABI 7500 PCR 5.7.2 实时荧 光定 量PCR 反 应条 件 95 30 s 95 5 s 62 32 s 40 6 结果判 定 6.1 6.2 4 PCR 568bp 568bp 568bp 4 B.1 6.3 4 PCR S Ct 35 S Ct 35 S Ct 35 4 B.2 DB37/T 3128.2 2020 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）相关试 剂的 配制 A.1 1.5%琼 脂糖 凝胶 的配 制 1.5 g 100 mL 5060 EB 5 L A.2 1TAE 电 泳缓 冲液 的配 制 A.2.1 配制0.5mol/L 乙 二胺 四乙 酸钠（EDTA-Na2）溶 液（pH 8.0）EDTA-Na2 2H2O 18.61 g 80.0 mL pH 8.0 100 mL A.2.2 50TAE A.2.2 配制50TAE 电 泳缓 冲液 Tris 242 g 57.1 mL 0.5mol/L EDTA-Na2 pH 8.0 100 mL 1000 mL A.2.3 1TAE A.2.3 配制1TAE 电 泳缓 冲液 20 mL 1000 mL A.3 溴化乙 锭的 配制 20 mg 20 mL A.4 核酸电 泳加 样缓 冲液（10）25 g 100 mL DB37/T 3128.2 2020 6 0.1g 0.1 g A.5 磷酸盐 缓冲 液（PBS，0.01mol/L pH 7.4）NaCl 8.0 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g Na2HPO4.12H2O 0.2 g 1000 mL DB37/T 3128.2 2020 7 B B 附 录 B（规范 性附 录）试验结 果图 示 B.1 PCR 产 物大 小对 照 M 1 N 图B.1 PCR 产 物大 小对 照图 B.2 荧光定 量PCR 扩 增曲 线 1 2 图B.2 荧光定 量PCR 扩 增曲 线 _