ICS 67.050 X 04 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4009 2020 阿胶及含 阿胶的食 品中动物 皮源性成 分鉴定方法 Identification of animal-derived materials in Ejiao and Ejiao-containing food 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4009 2020 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任。本标准 由青 岛海 关提 出、归口并 组织 实施。本标准 起草 单位：青 岛海 关技术 中心、东 阿阿 胶股 份有限 公司、中 国检 验检 疫科学 研究 院。本标准 主要 起草 人：张晓 梅、张 鸿伟、张 峰、周祥 山、田 守生、段 小波、梁 成珠、赵飒、凌 云、艾连峰。本标准 系首 次发 布。DB37/T 4009 2020 1 阿 胶及含 阿胶的食 品中动 物皮源性 成分鉴 定方法 1 范围 本标准 规定 了阿 胶及 含阿 胶的食 品中 驴皮 源性 成分、牛皮 源性 成分、猪 皮源 性成分、马（骡）皮 源性成分 的液 相色 谱-质谱/质谱鉴 定方 法。本标准 适用 于阿 胶块、阿 胶糕、阿胶 膏、阿 胶口 服 液、阿 胶浆、阿胶 粉、阿 胶颗粒 等阿 胶及 含阿 胶的食品 中动 物皮 源性 成分 的鉴定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 原理 试样经 粉碎后，用1%碳酸氢铵溶 液提取蛋白质，经胰蛋白 酶酶解后，采用 分子量截 留膜过滤获 取酶解肽 段溶 液，液相 色谱-质谱/质谱 测定 皮源 性特 征 肽段。4 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。4.1 阿胶 马科动 物驴Equus asinus L.的干 燥皮 或鲜 皮经 煎煮、浓缩 制成 的固 体胶。中华 人民 共和 国药 典 2015 版 一 部，第189 页 5 试剂与 材料 除另有 规定 外，所有 试剂 均为分 析纯，水 为符 合GB/T 6682 规定 的一 级水。5.1 试剂 5.1.1 乙腈：色谱 纯。5.1.2 甲酸：色谱 纯。5.1.3 碳酸氢 铵：优级 纯。5.1.4 胰蛋白 酶：序列 分析 纯。5.2 溶液配 制 DB37/T 4009 2020 2 5.2.1 1%碳 酸氢 氨溶 液：准确 称 取碳酸 氢铵（5.1.3）10.0 g，溶 于水 并稀 释至1 000 mL。5.2.2 1 mg/mL 胰 蛋白 酶溶 液：称 取 1 mg 胰 蛋白 酶（5.1.4），用1%碳 酸氢 铵溶 液（5.2.1）1 mL 溶解混匀，现用 现配。5.2.3 0.1%甲酸-水溶 液：取甲 酸（5.1.2）1 mL，用水 稀 释至 1 000 mL。5.2.4 0.1%甲酸-乙腈 溶液：取 甲酸（5.1.2）1 mL，用 乙 腈（5.1.1）稀 释至1 000 mL。5.3 对照品、对 照标 准肽 段 5.3.1 对照品：阿 胶（对照 药材）；新 阿胶（对 照药 材）；黄明 胶（对照 药材）。5.3.2 对照标 准肽 段：牛皮 特征 肽 A，纯度 94.0%；马 源 寡肽 A，纯 度96.0%。5.4 对照品、对 照标 准肽 段溶 液制备 5.4.1 1 mg/mL 对 照品 溶液：准 确 称取 10 mg 试样，用1%碳 酸氢铵 溶液 超声 处理 溶解，再 用 1%碳酸 氢铵溶液 定容 至 10 mL，摇 匀。-20 以 下避 光保 存，有效 期 6 个 月。5.4.2 对照标 准肽 段溶 液：a)1 mg/mL 对 照标 准肽 段储 备 液：准 确量 取 1%碳 酸氢 氨 溶液 1 mL 溶解 1 mg 对照 标 准肽段，溶 液浓度 为1 mg/mL。-20 以 下避光 保存，有 效 期6 个 月；b)0.01 mg/mL 对 照标 准肽 段 工作液：准 确移 取对 照标 准肽段 储备 液（5.4.2.a）100 L 于 10 mL容量瓶 中，并 用1%碳酸 氢 氨溶液 稀释 至刻 度，混匀，-20 以 下避 光保 存，有效 期 3 个 月。5.5 质控样 品 5.5.1 质控样 品：经过 确证 分析 为相应 皮源 的阳 性样 品或 阴性样 品。5.5.2 报告限 添加 样品：a)驴皮源 报告 限添 加样 品：取经确 证为 阴性 的样 品基 质 0.25 g，超 声溶于 25 mL 的 1%碳酸 氢 铵溶液中，取 100 L 阿 胶 对照品 溶液（5.4.1），用 上述样 品基 质溶 液定 容 至 1 mL，该样 品溶液相当 于 非 阿胶 样品 基质 中含 有 1%（w/w）的 阿胶，作为 驴皮 源性 的报 告限 添加样 品；b)其他皮 源报 告限 添加 样品：取经 确证 为阴 性的 样品 基质 0.25 g，超声 溶于 25 mL 的 1%碳酸氢铵溶液 中，分 别 取100 L 新阿 胶、黄 明胶 对照 品 溶液（5.4.1），5 L 马 源寡 肽 A 标 准工 作液（5.4.2.b），用 上述 样 品基质 溶液 定容至 1 mL，该样品 溶液 相当 于纯 阿胶 样品基 质中 掺入1%（w/w）的新 阿胶 和黄 明胶 及 50 ng/mL 的 马源 寡 肽 A，作为 猪皮 源性、牛 皮源性、马（骡）皮源性 的报 告限 添加 样品。5.6 材料 5.6.1 超滤离 心管：2 mL，分子 量 截留 值 10 kDa。5.6.2 滤膜：0.22 m。6 仪器和 设备 6.1 液相色 谱-质谱/质谱 分析 仪：配 有电 喷雾 离子 源（ESI）。6.2 分析天 平：感量 为0.01 g 和0.000 01 g。6.3 高速粉 碎机。6.4 超声波 仪。6.5 高速冷 冻离 心机。6.6 电热恒 温水 槽。DB37/T 4009 2020 3 7 试样的 制备 与保 存 7.1 试样的 制备 取出代 表性样品，固 体样品冷冻 后经粉碎机粉 碎，用四分 法缩分出不少 于5.0 g试 样；液体、粉 状及颗粒 样品均分成两份，每份不 少于5.0 g，装 入清洁容器 内，加封后作出标记，一 份作试样，一份 作留样。7.2 试样的 保存 按照样 品产 品标 签规 定的 贮藏条 件保 存，未标 明贮 藏条 件 的，常温 避光 保存。8 试验步 骤 8.1 提取及 净化 8.1.1 阿胶 准确称 取0.25 g（0.01 g）试 样，用1%碳 酸氢 铵溶 液 超声溶 解，再 用1%碳酸 氢 铵溶液 定容 至25 mL。取上述 溶液1.0 mL，过0.22 m滤 膜，精 密量取200 L滤液 至2 mL 超滤 离心管 滤膜管 中，加 胰蛋 白酶溶液（1 mg/mL）20 L，混匀，37 恒温 酶解16 h，15 000 g，4 离心10 min，收 集下 层滤 液待 上机检测。8.1.2 含阿胶 的食 品 准确称 取2.5 g（0.1 g）试样，用1%碳酸 氢铵 溶液 超声溶 解，再用1%碳 酸氢 铵 溶液 定容 至刻 度25 mL。将上述 溶液12 000 g，4 离心10 min，取 上清液1.0 mL，过0.22 m 滤膜，精密量 取200 L滤液至2 mL 超滤 离心 管滤 膜管 中，加 胰蛋 白酶 溶液（1 mg/mL）20 L，混 匀，37 恒温酶 解16 h，15 000 g，4 离 心10 min，收 集下 层 滤液待 上机 检测。8.1.3 对照品 及质 控样 品 对照品 及质 控样 品按 照相 应基质（8.1.1 或8.1.2）进行提 取及 净化。8.2 测定 8.2.1 色谱条 件 色谱参 考条 件：a)色谱柱：C18 色 谱柱（50 2.1 mm，1.3 m），或相 当 者；b)流动相：A:0.1%甲酸-水 B:0.1%甲酸-乙腈；c)流速：0.3 mL/min；d)进样量：10 L；e)柱温：30；f)流动相 梯度 洗脱 程序 见 表1。DB37/T 4009 2020 4 表1 梯度洗 脱程 序 时间 min A 相%B 相%0.0 95 5 1.0 95 5 4.5 70 30 5.5 70 30 5.6 5 95 6.6 5 95 6.7 95 5 8.0 95 5 8.2.2 质谱条 件 质谱参 考条 件：a)离子源：电 喷雾 离子 源；b)扫描方 式：正离 子扫 描；c)检测方 式：多反 应离 子监 测（MRM）；d)喷雾电 压、碰撞 能量、离 子源温 度等 参数 应优 化至 最优灵 敏度；e)脱溶剂 气、碰撞 气均 为高 纯氮气 或其 他合 适气 体；f)鉴定离 子相 关参 数参 见附 录 A，特征 肽段 选择 离子 流色谱 图参 见附 录B。8.2.3 测定分 析序 列控 制 测定分 析序 列应 当包 括对 照品溶 液、对照 标准 肽段 溶液、测试 样品 溶液、报 告限添 加样 品溶 液、质控样品（程 序空 白、溶剂 空白、阳性 质控 样或 阴性 质控样）溶 液。进样顺 序按 照对 照品 溶液、对照 标准 肽段 溶液、报 告限添 加样 品溶 液、溶剂 空白溶 液、测试 样品 溶液、溶 剂空 白溶 液、报告 限添加 样品 溶液、质 控样 品溶液、溶 剂空 白溶 液、报告限 添加 样品 溶液 依 次 分析。9 结果判 定规 则及 结果 报告 9.1 判定规 则 判定规 则如 下：a)试样 中各离子对 色谱保留时间 与相应对照 品或对照标准 肽段的离子 对保留时间相 比在2.5%的范围 内；b)阳性质 控样 品特 征肽 段相 应离子 对响 应不 低于 报告 限添加 样品 的相 应离 子对 响应；c)测试样 品相 应皮 源的 特征 肽段的 所有 离子 对响 应高 于报告 限添 加样 品的 相应 离子对 响 应 均 值；d)与对照 品或 对照 标准 肽段 离子对 的离 子比 率相 比，样 品中相 应离 子对 的离 子比 率容许 范 围 为 30%。9.2 结果报 告 DB37/T 4009 2020 5 若同时 满足9.1 规定 的各 项 判定规 则，则判 定样 品中 检出相 应皮 源性 成分；若 未同时 满足9.1 规定 的各项判 定规 则，则判 定样 品中未 检出 相应 皮源 性成 分。10 质量控 制 10.1 空白质 控样 品不 得出 现各 特征肽 段的 响应。10.2 阳性质 控样 品特 征肽 段相 应离子 对响 应应 高于 报告 限添加 样品 的相 应离 子对 响应均 值。10.3 报告限 添加 样品 中报 告限 判定离 子对 响应 的相 对标 准偏差 不超 过 15%。DB37/T 4009 2020 6 A A 附 录 A（资料 性附 录）各皮源 性成 分特 征肽 段鉴 定离子 对及 相关 参考 参数 表A.1 各皮源 性成 分特 征肽 段鉴 定离子 对及 相关 参考 参数 皮源 性成分特征肽段 鉴定 离子对 m/z 保留时间 min 解聚电压 DP 碰撞能量 v 牛皮源性 成分 特征 肽段 596.8/894.5 4.00 75 30 596.8/447.8 4.00 75 30 596.8/570.3 4.00 75 30 641.3/783.5 2.97 110 37 641.3/726.4 2.97 110 36 641.3/558.4*2.97 110 40 驴皮源性 成分 特征 肽段 765.9/991.6 4.14 87 36 765.9/1048.6 4.14 87 36 765.9/823.5 4.14 87 36 591.8/910.5 3.37 74 30 591.8/556.3 3.37 74 30 591.8/455.8*3.37 74 30 猪皮源性 成分 特征 肽段 486.2/545.3 0.92 67 26 486.2/602.3 0.92 67 26 486.2/786.4 0.92 67 26 590.8/570.4 3.71 74 30 590.8/447.8 3.71 74 30 590.8/669.4*3.71 74 30 马（骡）皮源性 成分 特征 肽段 386.3/377.4 1.15 75 16 386.3/499.3 1.15 75 20 386.3/643.4*1.15 75 19 备注：*为报告 限判定离子对 DB37/T 4009 2020 7 B B 附 录 B（资料 性附 录）4 种皮 源性 特征 肽段 选择 离子流 色谱 图 图B.1 驴皮源 特征 肽（765.9）选 择离子 流色 谱图 图B.2 驴皮源 特征 肽（591.8）选 择离子 流色 谱图 图B.3 牛皮源 特征 肽（596.8）选 择离子 流色 谱图 DB37/T 4009 2020 8 图B.4 牛皮源 特征 肽（641.3）选 择离子 流色 谱图 图B.5 猪皮源 特征 肽（486.2）选 择离子 流色 谱图 图B.6 猪皮源 特征 肽（590.8）选 择离子 流色 谱图 图B.7 马（骡）皮 源特 征肽（386.3）选 择离 子流 色谱 图 _