I C S 6 5.0 2 0.3 0C C S B 4 1DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 1 5 9 3 2 0 2 04 型 禽 腺 病 毒 抗 体 E L I S A 检 测 规 程T e c h n i c a l p r o c e d u r e s o f t h e E L I S A a s s a y s f o r d e t e c t i o n o f t y p e 4 a v i a n a d e n o v i r u s2 0 2 0-0 7-0 7 发 布 2 0 2 0-1 1-0 7 实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 4 2/T 2 0 2 0I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 实 验 原 理.15 检 测 条 件.16 检 测 方 法.27 结 果 判 定.38 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施.3附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 制.4D B 4 2/T 2 0 2 0I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 给 出 的 规则 起 草。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 管 理。本 文 件 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学，武 汉 科 前 生 物 股 份 有 限 公 司。本 文 件 主 要 起 草 人：金 梅 林、张 雪、邹 忠、林 显、孙 小 美、董 晓 辉、徐 高 原。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问，可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅，联 系 电 话：0 2 7-8 7 6 6 5 8 2 1，邮 箱：h b s n a b 1 2 6.c o m；华 中 农 业 大 学，联 系 电 话：0 2 7-8 7 2 8 2 0 3 8，邮 箱：x y s m a i l.h z a u.e d u.c n。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学，电 话：0 2 7-8 7 2 8 6 9 0 5，邮 箱：j m l 8 3 2 8 1 2 6.c o m。D B 4 2/T 2 0 2 0I I I引 言禽 腺 病 毒 属 于 禽 腺 病 毒 科 禽 腺 病 毒 属，根 据 其 抗 原 性 的 不 同 可 分 为 3 个 群，根 据 血 清 中 和 反 应 I 群 禽腺 病 毒 包 含 1 2 个 血 清 型，4 型 禽 腺 病 毒 主 要 感 染 3 周 龄 5 周 龄 鸡。我 国 主 要 流 行 血 清 型 有：2 型、4 型、8 a/b 型 和 1 0 型。近 期 在 豫 南、皖 北、苏 北、鲁 西 北 和 胶 东 地 区 流 行 的 禽 腺 病 毒 主 要 是 血 清 4 型 和 8 a/b 型，造 成 鸡 群 的 死 亡 率 较 高，发 病 急，有 蔓 延 的 趋 势。对 我 国 的 养 禽 业 造 成 了 巨 大 的 经 济 损 失。D B 4 2/T 2 0 2 014 型 禽 腺 病 毒 抗 体 E L I S A 检 测 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 4 型 禽 腺 病 毒 抗 体 E L I S A 检 测 的 术 语 和 定 义、实 验 原 理、检 测 条 件、检 测 方 法、结 果 判定、废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施。本 文 件 适 用 于 4 型 禽 腺 病 毒 鸡 血 清 抗 体 的 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法。3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4 实 验 原 理本 文 件 采 用 酶 联 免 疫 吸 附 法（E L I S A），该 方 法 利 用 抗 原 抗 体 反 应 具 有 特 异 性，将 特 异 性 的 4 型 禽 腺病 毒 五 邻 体 蛋 白（p e n t o n）吸 附 到 固 相 载 体 的 表 面 后，待 测 物 中 若 含 有 相 应 的 4 型 禽 腺 病 毒 抗 体，则 可与 所 包 被 的 五 邻 体 蛋 白（p e n t o n）相 结 合，并 能 继 续 和 相 应 的 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸡 I g G 抗 体 结 合 形成 复 合 物。加 入 酶 反 应 的 底 物 后，底 物 被 酶 催 化 成 为 有 色 产 物，产 物 的 量 与 待 测 物 中 4 型 禽 腺 病 毒 抗 体的 量 直 接 相 关，故 可 根 据 呈 色 的 深 浅 进 行 定 性 或 定 量 分 析。由 于 酶 的 催 化 效 率 很 高，间 接 地 放 大 了 免 疫反 应 的 结 果，使 测 定 方 法 达 到 很 高 的 敏 感 度。5 检 测 条 件5.1 试 剂 及 耗 材5.1.1 试 剂纯 化 的 4 型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白（p e n t o n）、酶 标 记 物（辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸡 I g G 抗 体）、底 物液 显 色 液、终 止 液、阳 性 对 照、阴 性 对 照、样 品 稀 释 液、2 0 倍 浓 缩 洗 涤 液、包 被 液、封 闭 液。试 剂 配 方 及 4 型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白、阳 性 对 照、阴 性 对 照 的 制 备 见 附 录 A。5.1.2 耗 材酶 标 板（9 6 孔）。5.2 设 备D B 4 2/T 2 0 2 02酶 标 检 测 仪（配 备 4 5 0 n m 滤 光 片）、单 道 移 液 器（1 0 L）、8 道 移 液 器（3 0 0 L）、微 量 振 荡 器、恒温 箱（3 7）。6 检 测 方 法6.1 抗 原 包 被 板 的 制 备6.1.1 包 被将 纯 化 的 4 型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白（p e n t o n）用 包 被 液 稀 释 到 0.6 2 5 n g/L，加 入 酶 标 板 中，每 孔 加1 0 0 L，2 8 包 被 1 2-1 5 h。6.1.2 封 闭弃 去 包 被 液，每 孔 加 入 封 闭 液 2 0 0 L，置 3 7 恒 温 箱 中 温 育 2 h；弃 去 孔 中 液 体，再 置 3 7 恒 温 箱 中干 燥 2 h，密 封 2 8 保 存。6.2 洗 涤 液 的 配 制使 用 前，将 2 0 倍 浓 缩 洗 涤 液 恢 复 至 室 温 2 2 2 5，并 摇 动 使 沉 淀 溶 解，按 照 5 0 m L 2 0 倍 浓 缩 洗 涤液 加 入 9 5 0 m L 去 离 子 水 的 比 例 稀 释，稀 释 好 的 洗 涤 液 在 2 8 保 存，有 效 期 为 7 日。6.3 待 检 血 清 的 稀 释将 5 L 血 清 加 入 到 9 5 L 样 品 稀 释 液 中，微 量 振 荡 器 混 匀，再 取 5 L 混 匀 后 的 血 清 加 入 到 1 2 0 L 样 品 稀释 液 中，微 量 振 荡 器 混 匀 备 用。6.4 检 测 步 骤6.4.1 待 检 样 品 温 育从 冷 藏 环 境 中 取 出 包 被 板，平 衡 至 室 温 2 2 2 5 后 打 开 使 用。先 用 洗 涤 液 洗 涤 抗 原 包 被 板 1 次，弃 去 孔 中 洗 涤 液，将 稀 释 好 的 待 检 血 清、阴 性 对 照 和 阳 性 对 照 各 取 1 0 0 L，加 至 抗 原 包 被 板 中，阴、阳性 对 照 各 设 2 孔，置 3 7 恒 温 箱 中 温 育 4 5 m i n。阴 性 对 照 血 清 和 阳 性 对 照 血 清 无 需 稀 释。6.4.2 洗 涤弃 去 孔 中 液 体，每 孔 加 入 洗 涤 液 3 0 0 L/孔，重 复 洗 涤 4 次，最 后 一 次 拍 干。6.4.3 酶 标 记 物 的 温 育将 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸡 I g G 抗 体 用 封 闭 液 作 1:2 0 0 0 0 倍 稀 释，每 孔 加 入 1 0 0 L，置 3 7 恒 温 箱 中温 育 4 5 m i n。6.4.4 洗 涤重 复 步 骤 5.4.2。6.4.5 底 物 显 色每 个 反 应 孔 加 入 底 物 显 色 液 1 0 0 L，置 2 2 2 8 下 避 光 显 色 1 5 m i n。D B 4 2/T 2 0 2 036.4.6 终 止每 孔 加 终 止 液 5 0 L，1 0 m i n 内 用 酶 标 仪 在 波 长 4 5 0 n m 处 测 定 各 孔 的 O D 值 结 果。7 结 果 判 定7.1 试 验 成 立 条 件两 个 阳 性 对 照 孔 的 O D4 5 0 n m值 均 1.0，且 相 差 0.2；阴 性 对 照 孔 O D4 5 0 n m值 均 0.3 时 试 验 成 立。7.2 结 果 计 算C u t-o f f 值 按 式（1）确 定：N PN SCO off Cut）值（1）式 中：C O 阴 阳 性 判 定 临 界 值；S 样 品 测 定 孔 O D4 5 0 n m值；P 阳 性 对 照 孔 平 均 O D4 5 0 n m值；N 阴 性 对 照 孔 平 均 O D4 5 0 n m值。7.3 结 果 判 定C O 0.1 5 判 定 为 阳 性；C O 0.1 5 判 定 为 阴 性。8 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 安 全 防 护 工 作，废 弃 物 应 做 好 无 害 化 处 理。D B 4 2/T 2 0 2 04A A附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 制A.1 包 被 液碳 酸 钠（N a2C O3）1.5 9 g，碳 酸 氢 钠（N a H C O3）2.9 3 g，加 水 至 1 0 0 0 m L，置 2 8 保 存 备 用。水 的规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2。A.2 洗 涤 液氯 化 钠（N a C l）8 g，氯 化 钾（K C l）0.2 g，十 二 水 磷 酸 氢 二 钠（N a2H P O4 1 2 H2O）2.9 g，磷 酸 二 氢钾（K H2P O4）0.2 g，T w e e n-2 0 0.5 m L，加 水 至 1 0 0 0 m L，置 2-8 保 存 备 用。水 的 规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2。A.3 底 物 液3,3,5,5-四 甲 基 联 苯 胺（T M B）显 色 液，置 2 8 保 存 备 用。A.4 终 止 液0.5 m o l/L 硫 酸（H2S O4）。A.5 样 品 稀 释 液氯 化 钠（N a C l）8 g，氯 化 钾（K C l）0.2 g，十 二 水 磷 酸 氢 二 钠（N a2H P O4 1 2 H2O）2.9 g，磷 酸 二 氢 钾（K H2P O4）0.2 g，加 至 1 0 0 0 m L，置 2-8 保 存 备 用。水 的 规 格 符 合 G B/T 6 6 8 2。A.6 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白（B S A）5 g，氯 化 钠（N a C l）8 g，氯 化 钾（K C l）0.2 g，十 二 水 磷 酸 氢 二 钠（N a2H P O4 1 2 H2O）2.9 g，磷 酸 二 氢 钾（K H2P O4）0.2 g，硫 柳 汞 钠 0.2 g，加 水 至 1 0 0 0 m L，置 2-8 保 存 备 用。水 的 规 格 符 合G B/T 6 6 8 2。A.7 抗 原 制 备（4 型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白 制 备）将 I 群 禽 腺 病 毒 4 型 H B 1 5 0 2 株 的 五 邻 体 蛋 白（p e n t o n）基 因 克 隆 到 原 核 表 达 载 体 p E T-3 2 a 上。将 构 建成 功 的 原 核 表 达 质 粒 p E T-p e n t o n 转 化 B L-2 1（D E 3）感 受 态 中。挑 取 单 菌 落 进 行 诱 导，用 S D S-P A G E 和 w e s t e r nb l o t 进 行 鉴 定。将 成 功 表 达 五 邻 体 蛋 白 的 菌 种 接 种 于 含 2 5 g/m L 氨 苄 青 霉 素 的 L B 培 养 基 中，2 0 0 r/m i n、3 7 摇 床 振 荡 培 养 8 h 1 2 h 后，置 2 8 保 存 过 夜。次 日 将 上 述 菌 液 按 1:1 0 0 接 种 于 含 2 5 g/m L 氨 苄 青 霉素 的 L B 培 养 基 中，2 0 0 r/m i n、3 7 摇 床 振 荡 培 养 至 对 数 生 长 期（菌 液 浓 度 O D6 0 0 n m达 到 0.6 0），用 终 浓 度0.1 m m o l/L 的 I P T G 2 8 摇 床 诱 导 培 养 6 h 后，取 出 菌 液 备 用。D B 4 2/T 2 0 2 05将 诱 导 表 达 后 的 菌 液 1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，弃 上 清，收 集 菌 体。收 集 的 菌 体 用 1/1 0 培 养 基 体 积 的B i n d i n g b u f f e r（5 0 m m o l/L T r i s-B a s e，0.0 1 m m o l/L 咪 唑，p H 7.9）悬 浮 后，用 压 力 破 碎 仪 充 分 破 碎 至半 透 明。破 碎 的 菌 液 经 1 2 0 0 0 r/m i n 离 心 2 0 m i n，收 集 上 清 并 过 滤，置 2 8 备 用。采 用 组 氨 酸 层 析 柱 纯化，纯 化 方 法 按 p E T-3 2 a 表 达 载 体 纯 化 说 明 书 进 行，具 体 方 法 如 下：将 灌 制 好 的 预 装 柱 用 3 倍 柱 体 积 的 2 0%无 水 乙 醇 清 洗，再 用 B i n d i n g b u f f e r 平 衡，待 监 测 仪 显 示 的 曲 线 平 衡 后 加 入 处 理 好 的 细 菌 上 清 液，以 6 1 0 倍 W a s h i n g b u f f e r（5 0 m m o l/L T r i s-B a s e，0.0 1 m m o l/L 咪 唑，p H 7.9）洗 去 未 结 合 的 杂 蛋 白，用1 0 0%E l u t i o n b u f f e r（5 0 m m o l/L T r i s-B a s e，0.0 1 m m o l/L 咪 唑，p H 7.9）洗 脱 目 的 蛋 白 并 收 集，最 后 用2 0%无 水 乙 醇 清 洗 预 装 柱 并 封 存。收 集 目 的 蛋 白 经 检 验 合 格 后 分 装，置-8 0 保 存 备 用，作 为 4 型 禽 腺 病毒 抗 体 E L I S A 检 测 规 程 的 包 被 抗 原。A.8 阳 性 对 照 制 备实 验 室 分 离 纯 化 的 I 群 禽 腺 病 毒 4 型 H B 1 5 0 2 株，在 L M H 细 胞 上 增 殖，病 毒 滴 度 为 1 07.2T C I D5 0/m L，经 1 甲 醛 灭 活，M a r c o l 5 2 佐 剂 乳 化 后 作 为 免 疫 原 免 疫 3-4 周 龄 S P F 鸡。颈 部 皮 下 免 疫 3 次，每 次 间 隔 1 4 日，第 1次 和 第 2 次 免 疫 0.2 m L/只，第 3 次 免 疫 0.5 m L/只，末 次 免 疫 后 1 4 日 采 血 用 B i o C h e k 禽 腺 病 毒 1 群（F A D V-1）抗 体 检 测 试 剂 盒 检 测 抗 体 效 价。待 检 血 清 E L I S A 效 价 达 到 1:6 4 0 以 上，采 取 颈 部 动 脉 采 血 方 式，无 菌 采 集 血 液，待 血 液 充 分 凝 固 后，4 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n 分 离 血 清 离 心 分 离 血 清。按 血 清 量 的 0.0 4 加 入 硫 柳 汞，并 将 血 清 用 样 品 稀 释 液 进行 稀 释，调 整 到 4 型 禽 腺 病 毒 抗 体 E L I S A 检 测 方 法 检 测 O D4 5 0 n m值 在 1.6 2.0 之 间。0.2 2 m 滤 器 过 滤 除 菌 分装，1 m L/管，置 2 8 保 存 备 用，作 为 4 型 禽 腺 病 毒 抗 体 E L I S A 检 测 规 程 的 阳 性 对 照。A.9 阴 性 对 照 制 备选 用 7-8 周 龄 S P F 鸡（用 B i o C h e k 禽 腺 病 毒 1 群（F A D V-1）抗 体 检 测 试 剂 盒 和 聚 合 酶 链 式 扩 增 反 应（P C R）检 测 4 型 禽 腺 病 毒 抗 体 与 抗 原 为 阴 性），隔 离 观 察 7 日。采 取 颈 部 动 脉 采 血 方 式，无 菌 采 集 血 液，待 血 液 充 分 凝 固 后，4 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n 分 离 血 清 离 心 分离 血 清。按 血 清 量 的 0.0 4 加 入 硫 柳 汞，并 将 血 清 用 样 品 稀 释 液 进 行 1:5 0 0 倍 稀 释。0.2 2 m 滤 器 过 滤 除菌 分 装，1 m L/管，置 2 8 保 存 备 用，4 型 禽 腺 病 毒 抗 体 E L I S A 检 测 规 程 的 阴 性 对 照。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _