I C S 6 5.0 2 0.2 0B 0 5DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 9主 要 肥 效 微 生 物 筛 选 技 术 规 程2 0 1 9-1 2-1 3 发 布 2 0 2 0-0 1-1 2 实 施黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 9I前 言本 标 准 依 据 G B/T 1.1 的 编 写 规 则 起 草。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 土 壤 肥 料 与 环 境 资 源 研 究 所 和 哈 尔 滨 市 芮 煊 科 技 有 限 公 司 起 草。本 标 准 主 要 起 草 人：王 爽、赵 晓 宇、李 伟 群、陈 雪 丽、万 书 明、孙 磊、姜 辉、王 晓 军、张 磊、常 本超。D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 91主 要 肥 效 微 生 物 筛 选 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 主 要 肥 效 微 生 物 筛 选 技 术 的 术 语 和 定 义，样 品 采 集，肥 效 微 生 物 的 筛 选 及 保 藏。本 标 准 适 用 于 根 瘤 菌、溶 磷 菌 和 解 钾 菌 三 种 肥 效 微 生 物 的 筛 选。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本 文 件。N Y/T 8 8 9-2 0 0 4 土 壤 速 效 钾 和 缓 效 钾 含 量 的 测 定L Y/T 1 2 3 2-2 0 1 5 森 林 土 壤 全 磷 的 测 定S N/T 2 6 3 2 微 生 物 菌 种 常 规 保 藏 技 术 规 程3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1肥 效 微 生 物从 自 然 界 分 离 筛 选，通 过 自 身 代 谢 活 动 产 生 固 氮、溶 磷、解 钾 等 功 能，使 植 物 获 得 特 定 肥 料 效 应，并 可 用 于 微 生 物 肥 料 生 产 的 微 生 物。本 标 准 中 的 肥 料 微 生 物 主 要 指 根 瘤 菌、溶 磷 菌 和 解 钾 菌。3.2透 明 圈在 琼 脂 平 板 上，溶 磷 菌 在 培 养 过 程 中 分 泌 有 机 酸，将 培 养 基 中 不 透 明 的 难 溶 磷 酸 钙 溶 解 后 形 成 的 透明 区。4 样 品 采 集4.1 主 要 用 具铁 锹、小 铲、镊 子、G P S 定 位 仪、记 号 笔、装 土 袋 子（布 袋）、塑 料 袋、剪 子、标 签 纸、冰 盒、7 5%酒 精、吸 水 纸、变 色 硅 胶 离 心 管。4.2 根 瘤 样 品 采 集4.2.1 采 样 时 间选 择 豆 科 作 物 盛 花 期 采 集 根 瘤。4.2.2 采 样 方 法D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 92视 土 壤 水 分、通 气 状 况 和 植 株 大 小 决 定 植 物 根 系 的 挖 掘 深 度，将 整 株 植 物 的 根 系 挖 出，轻 轻 敲 掉 根系 周 围 大 的 土 块，然 后 将 根 放 入 塑 料 袋 中，贴 好 标 签 带 回 实 验 室。4.2.3 根 瘤 样 品 的 保 存轻 轻 抖 去 根 系 上 的 土 壤，将 根 在 水 中 浸 泡、洗 净、晾 干 或 用 吸 水 纸 吸 干。用 剪 刀 将 主 根 上 个 大、粉红 色 的 瘤 子（带 点 根）小 心 剪 下，保 存 于 盛 有 干 燥 剂（采 用 变 色 硅 胶）的 5 m L 的 离 心 管 中，置 于 4 条件 下 冷 藏 存 放，每 天 对 保 存 物 进 行 检 查，发 现 硅 胶 由 蓝 色 完 全 变 为 红 色 时，应 及 时 转 移 到 新 管 子 中。在1 5 d 内 完 成 根 瘤 菌 的 分 离 工 作。4.3 土 壤 样 品 采 集4.3.1 采 样 时 间溶 磷、解 钾 微 生 物 来 源 的 土 壤 样 品 采 集 可 在 植 物 生 长 的 整 个 过 程 中 进 行。4.3.2 采 样 方 法去 掉 地 表 大 块 沙 石 和 其 他 杂 物。根 际 土 壤，用 干 净 铁 锹 或 小 铲 沿 植 物 周 围 往 下 挖，尽 量 将 整 株 植 物的 根 系 挖 出，轻 轻 敲 掉 根 系 周 围 大 的 土 块，然 后 将 根 放 入 塑 料 袋 中，将 根 上 土 抖 下 或 用 手 从 塑 料 袋 外 从根 上 撵 下，贴 上 标 签，封 口，同 时 在 塑 料 封 口 袋 上 写 清 采 样 编 号，放 入 冰 盒 带 回 实 验 室 处 理。根 围 土 壤，采 样 深 度 一 般 是 0 c m 3 0 c m 土 层，需 记 录 采 取 土 样 的 深 度（c m）和 距 离 植 株 根 系 的 距 离（c m），沿 植 物外 1 0 c m 周 围 往 下 挖 5 c m 2 0 c m 的 土 壤，在 植 物 周 围 对 称 采 集 5 个 点 的 土 壤 样 本。然 后 放 入 塑 料 袋 中，贴 上 标 签，封 口，同 时 在 塑 料 封 口 袋 上 写 清 采 样 编 号，放 入 冰 盒 带 回 实 验 室 处 理。采 集 不 同 采 样 点 前 需将 工 具 上 的 残 土 清 理 干 净。5 肥 效 微 生 物 的 筛 选5.1 根 瘤 菌 的 筛 选5.1.1 根 瘤 菌 的 分 离4.2.3 中 的 保 存 的 根 瘤 样 品 用 9 5%乙 醇 浸 泡 根 瘤 3 0 s，无 菌 水 清 洗 3 次 4 次，再 用 0.1%升 汞（氯 化 汞）浸 泡 根 瘤 5 m i n，再 用 无 菌 水 冲 洗 根 瘤 4 次 5 次。在 无 菌 环 境 下 用 无 菌 刀 片 切 开 根 瘤，用 无 菌 镊 子 夹 取 根瘤，使 横 断 面 接 触 配 置 好 的 Y M A 培 养 基（配 置 方 法 见 附 录 A 1）斜 面 或 平 板 表 面，并 将 根 瘤 内 汁 液 涂 布 于培 养 基 表 面，在 试 管 或 培 养 皿 表 面 写 好 编 号，放 在 2 5 2 8 恒 温 培 养 箱 中 倒 置 培 养，在 2 0 d 内 每 天 观察，视 菌 落 生 长 情 况 决 定 培 养 时 间。5.1.2 根 瘤 菌 的 纯 化事 先 准 备 好 无 菌 的 带 玻 璃 珠 加 水 的 试 管 或 离 心 管 一 支，在 无 菌 环 境 下 从 试 管 或 平 板 上 长 出 的 乳 白色、凸 起 菌 落 挑 出 一 接 种 环 入 管 内 水 中，在 振 荡 器 上 振 荡 1 m i n，使 菌 苔 充 分 分 散 成 菌 悬 液，取 一 环 菌 液在 Y M A 固 体 培 养 基 上 划 线 接 种，平 板 放 在 2 5 2 8 恒 温 培 养 箱 中 倒 置 培 养。待 菌 落 长 出 后，挑 取 乳 白色、凸 起 的 菌 落 反 复 划 线 3 次 以 上 获 得 纯 菌 落。5.1.3 根 瘤 菌 结 瘤 能 力 的 验 证可 选 用 如 下 三 种 方 法 之 一 进 行 根 瘤 菌 的 回 接 结 瘤 实 验：D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 93a）水 培 法：培 养 基 质 为 微 氮 培 养 液，其 配 方 见 附 录 A 6 和 A 7，按 照 附 录 B 1 的 步 骤 完 成 根 瘤 菌 结 瘤 能力 的 验 证。b）砂 培 法：培 养 基 质 为 加 入 微 氮 培 养 液 的 石 英 砂，按 照 附 录 B 2 的 步 骤 完 成 根 瘤 菌 结 瘤 能 力 的 验 证。c）土 培 法：培 养 基 质 为 灭 菌 土 壤，按 照 附 录 B 3 的 步 骤 完 成 根 瘤 菌 结 瘤 能 力 的 验 证。观 察 各 植 株 根 部 结 瘤 情 况，记 录 植 株 株 高（c m）、主 根 和 侧 根 的 瘤 数（个/株）、主 根 和 侧 根 瘤 重（g/株）、地 上 部 鲜 重（g/株）。5.2 溶 磷、解 钾 菌 的 筛 选5.2.1 溶 磷、解 钾 菌 的 分 离称 取 土 样 1 0 g，置 于 装 有 无 菌 玻 璃 珠 的 三 角 瓶 中，分 离 溶 磷 菌 应 加 入 9 0 m L 无 菌 水，分 离 解 钾 菌 应 加入 0.8 5%N a C l 溶 液。常 温 下 以 1 6 0 r p m/m i n 的 转 速 振 荡 2 0 m i n，制 成 均 匀 的 土 壤 悬 液。采 用 1 0 倍 稀 释 法 依 次配 制 1 0-1 1 0-6的 浓 度 梯 度 样 液，选 取 1 0-4、1 0-5、1 0-63 个 浓 度 梯 度 的 样 液。分 离 解 磷 菌 时，每 次 每 个 浓度 样 液 吸 取 0.1 m L，涂 布 于 P K O 无 机 磷（附 录 A 2）和 蒙 金 娜 有 机 磷（附 录 A 3）固 体 培 养 基 平 板 上，每 个 稀释 度 设 3 个 重 复，3 0 培 养 箱 中 倒 置 培 养 7 d；分 离 解 钾 菌 时，每 次 每 个 浓 度 样 液 吸 取 0.1 m L，涂 布 于 解 钾菌 筛 选 培 养 基（附 录 A 4）平 板 上，每 个 稀 释 度 设 3 个 重 复，2 8 培 养 箱 中 倒 置 培 养 3 d 4 d。5.2.2 溶 磷、解 钾 菌 的 纯 化挑 取 每 个 梯 度 的 平 板 上 有 透 明 圈 的 菌 落，并 用 1，2，3，4.来 标 注，测 量 透 明 圈 直 径（D）、菌 落直 径（d），根 据 是 否 产 生 透 明 圈 以 及 D/d 值 大 小 来 初 步 确 定 菌 株 的 溶 磷 解 钾 能 力 的 强 弱。判 定 标 准 如 下：解 磷（钾）效 果 弱：0 D/d 1.0解 磷（钾）效 果 中 等：1.0 D/d 1.5解 磷（钾）效 果 较 强：1.5 D/d 3.0解 磷（钾）效 果 强：D/d 3.0将 D/d 1.5 的 菌 落 利 用 平 板 划 线 法 分 离 纯 化 后，再 用 接 种 针 挑 取 有 明 显 透 明 圈 的 菌 落，进 一 步 通 过平 板 划 线 法 纯 化，直 至 得 到 纯 菌 株 后，转 到 牛 肉 膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基（附 录 A 5）上，保 存 于 4 冰 箱 中。5.2.3 溶 磷 能 力 的 测 定在 5 0 0 m L 三 角 瓶 中 分 别 装 入 1 0 0 m L 的 P K O 无 机 磷 液 体 培 养 基（附 录 A 2 无 琼 脂）和 1 0 0 m L 蒙 金 娜 有 机 磷 液体 培 养 基（附 录 A 3 无 琼 脂），1 2 1 高 压 灭 菌 3 0 m i n 后 备 用。然 后 将 溶 磷 圈 法 初 筛 得 到 的 菌 株 接 种 到 牛 肉膏 蛋 白 胨 斜 面 培 养 基 上，于 2 8 培 养 2 4 h，挑 取 细 菌 接 入 到 无 菌 水 中，制 成 含 菌 量 1 07个/m L 的 菌 悬 液，取 1 m L 菌 悬 液，分 别 对 应 接 种 至 P K O 无 机 磷 液 体 培 养 基 和 1 0 0 m L 蒙 金 娜 有 机 磷 液 体 培 养 基，以 培 养 基 中 加入 1 m L 无 菌 水 作 为 对 照，每 个 处 理 3 次 重 复，振 荡 培 养（2 8，1 5 0 r p m/m i n）5 d。然 后 在 4 条 件 下 对 培养 液 进 行 离 心（4 0 0 0 r p m/m i n）1 5 m i n，吸 取 上 清 液，按 照 L Y/T 1 2 3 2-2 0 1 5 中 4 有 效 磷 的 测 定 方 法 测 定 上清 液 可 溶 性 磷 含 量。5.2.4 解 钾 能 力 的 测 定将 在 三 角 瓶 中 培 养 好 的 解 钾 细 菌 发 酵 液 倒 出，从 中 定 容 5 0 m L，将 发 酵 液 在 5 0 0 r p m/m i n 下 离 心 1 0 m i n，除 去 发 酵 液 中 的 不 溶 性 物 质，然 后 取 1 0 m L 菌 液 1 0 0 0 0 r p m/m i n 离 心 1 0 m i n，上 清 液 中 的 钾 含 量 测 定 按 照 N Y/T8 8 9-2 0 0 4 中 3.1 的 规 定 测 定 速 效 钾 含 量。测 定 菌 体 钾 含 量 之 前，先 将 菌 体 与 残 渣 经 碾 钵 充 分 撵 磨，用 1 0 m L去 离 子 水 浸 提，再 用 移 液 管 吸 取 4 m L 上 清 液 与 4 m L 6 m m o l/L 的 L i C l 充 分 混 匀，按 照 N Y/T 8 8 9-2 0 0 4 中 3.1的 规 定 测 定 速 效 钾 含 量。6 肥 效 微 生 物 的 保 藏D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 946.1 根 瘤 菌 的 保 藏挑 取 结 瘤 能 力 强 的 根 瘤 菌 进 行 保 藏，按 照 S N/T 2 6 3 2 的 规 定 进 行。6.2 溶 磷、解 钾 微 生 物 的 保 藏挑 选 生 长 旺 盛、具 有 较 大 溶 磷、解 钾 圈 的 菌 株 进 行 保 藏，按 照 S N/T 2 6 3 2 的 规 定 进 行。D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 95附 录 A（规 范 性 附 录）培 养 基 配 方 及 缓 冲 液A 1 Y M A 培 养 基甘 露 醇，1 0.0 g；酵 母 粉，0.8 g；K2H P O4，0.2 5 g；K H2P O4，0.2 5 g；M g S O4 7 H2O，0.2 g；N a C l，0.1 g；0.2 5%溴 麝 香 草 酚 蓝（仅 在 从 根 瘤 中 分 离 根 瘤 菌 时 选 择 性 的 加 入），1 m l；琼 脂，1 5 g 1 8 g；蒸 馏 水，1 0 0 0 m l；p H 值，6.8 7.0。A 2 P K O 无 机 磷 培 养 基葡 萄 糖，1 0 g；C a3(P O4)2，5 g；(N H4)S O40.5 g；N a C l，0.2 g；K C l，0.2 g；M g S O4 7 H2O，0.3 g；M n S O4 4 H2O，0.0 3 g；F e S O4 7 H2O，0.0 3 g；酵 母 膏，0.5 g；琼 脂，1 5 g 2 0 g；蒸 馏 水，1 0 0 0 m L；p H 值，6.8 7.0。A 3 蒙 金 娜 有 机 磷 培 养 基葡 萄 糖，1 0 g；(N H4)S O4，0.5 g；N a C l，0.3 g；K C l，0.3 g；F e S O4 7 H2O，0.0 3 g；M n S O4 4 H2O，0.0 3 g；卵 磷 脂，0.2 g；C a C O3，5 g；酵 母 膏，0.4 g；琼 脂，1 5 g 2 0 g；蒸 馏 水，1 0 0 0 m L；p H 值，7.0 7.2。A 4 解 钾 菌 筛 选 培 养 基蔗 糖，5 g；N a2H P O4，2 g；M g S O4 7 H2O，0.5 g；F e C l3,0.0 0 5 g；C a C O3，0.1 g；钾 长 石 粉，1 g（过 1 0 0目 筛 后 无 菌 水 浸 泡 3 d，除 去 水 溶 性 钾），琼 脂，1 8 g 2 0 g；蒸 馏 水，1 0 0 0 m L；p H 值，7.0 7.5。A 5 牛 肉 膏 蛋 白 胨 培 养 基牛 肉 膏，3 g；蛋 白 胨，5 g；琼 脂 1 8 g 2 0 g；蒸 馏 水，1 0 0 0 m L；p H 值，7.0 7.2。A 6 液 体 微 氮 培 养 基C a(N O3)2 4 H2O，0.0 3 g；C a S O4，0.4 6 g；K C l，0.0 7 5 g；M g S O4 7 H2O，0.0 6 g；K2H P O4，0.1 3 6 g；柠 檬 酸铁，0.0 7 5 g；微 量 元 素，1 m L；蒸 馏 水，1 0 0 0 m L。A 7 微 量 元 素H3B O3，2.8 6 g；M n S O4，1.8 1 g；Z n S O4，0.2 2 g；C u S O4 5 H2O,0.8 g；H2M o O4，0.0 2 g；蒸 馏 水 1 0 0 0 m L。附 录 B（规 范 性 附 录）试 验 方 法B 1 水 培 法B 1.1 微 氮 培 养 液 的 配 制按 附 录 A 6 和 A 7 将 各 种 成 分 称 好 后，放 入 1 0 0 0 m L 烧 杯 中 加 水 使 之 溶 解，即 为 培 养 液（可 先 配 制 成 浓 缩液，然 后 定 量 稀 释 装 瓶）。将 滤 纸 剪 成 合 适 大 小，卷 成 筒 放 入 大 试 管 内（5 c m 2 0 c m），并 贴 于 试 管 内壁 上，以 固 定 发 芽 的 种 子；培 养 液 装 入 大 试 管 中，用 透 气 滤 膜 和 牛 皮 纸 封 口，1 2 1 灭 菌 3 0 m i n 后 冷 却 备用。B 1.2 幼 苗 培 养挑 取 饱 满、新 鲜、无 破 损 的 豆 科 植 物 种 子，放 入 灭 菌 容 器（培 养 皿 或 烧 杯）内 按 本 标 准 5.1.1 中 消毒 根 瘤 的 方 法 进 行 消 毒 后，放 入 垫 有 滤 纸 的 加 无 菌 水 的 无 菌 培 养 皿 或 0.5%的 水 琼 脂 平 板 上，放 于 2 0 2 5 培 养 箱 内 发 芽。待 种 子 幼 苗 根 系 长 至 1 c m 2 c m，即 可 接 种 并 播 种 到 已 经 灭 菌 备 用 的 大 试 管 中。B 1.2 接 种 及 培 养根 据 植 物 种 子 萌 发 的 时 间 和 条 件，预 先 将 回 接 的 菌 株 在 Y E M 斜 面 上 活 化 后，于 Y E M 液 体 培 养 基 扩 大 培养 至 对 数 生 长 期。将 1 m L 菌 悬 液 倒 入 无 菌 培 养 皿 中，选 择 附 录 B 1.2 中 生 长 一 致 的 幼 苗 在 其 中 浸 泡 3 0 m i n后 转 移 到 无 菌 试 管 中，剩 余 的 菌 液 直 接 加 到 培 养 植 物 的 容 器 中，液 体 内 菌 液 浓 度 以 1 03 1 06C F U/m L 为 宜。大 试 管 外 包 裹 一 层 锡 纸 或 牛 皮 纸，以 避 光 模 拟 根 部 环 境。回 接 后 应 立 即 送 光 照 室、温 室 或 自 然 光 照 下 培养，温 度 以 1 2 2 5 为 宜，经 常 观 察 并 补 加 水 分。B 2 砂 培 法D B 2 3/T 2 5 2 5 2 0 1 96将 灭 过 菌 的 石 英 砂 等 基 质 装 入 花 盆 中，加 入 微 氮 培 养 液，将 附 录 B 1.2 中 生 长 一 致 的 幼 苗 移 入 石 英 砂中，培 养 同 附 录 B 1.3。B 3 土 培 法将 灭 过 菌 的 土 装 入 花 盆 中，装 土 量 视 花 盆 大 小 而 定。将 附 录 B 1.2 中 生 长 一 致 的 幼 苗 移 入 花 盆 中，培养 同 附 录 B 1.3。