ICS 11.220 B 41 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2269 2020 猪圆环病 毒 2 型与3 型双重荧光定量PCR检测方法 Duplex fluorescence quantitative PCR method for the detection of porcine circovirus type 2 and type 3 2020-06-30 发布 2020-07-30 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB33/T 2269 2020 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB33/T 2269 2020 1 猪 圆环病 毒 2 型与 3 型双 重荧光定 量 PCR 检测方法 1 范围 2 3 PCR 2 3 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682-2008 3 缩略语 Ct Cycle threshold DNA Deoxyribonucleic Acid PBS Phosphate Buffer Solution PCR Polymerase Chain Reaction PCV-2 2 Porcine Circovirus 2 PCV-3 3 Porcine Circovirus 3 Taq Taq DNA Taq DNA polymerase 4 试剂和 材料 0.01 mol/L PBS 8 mmol/L NaOH GB/T 6682-2008 4.1 DNAzol Reagent DNA 4.2 4.3 75%-4.4 8 mmol/L NaOH A 4.5 0.01 mol/L PBS pH 7.2 A 4.6 PCR buffer HS Taq dNTPs Mg2+RNaseH 4.7 2 3 PCV-3 ORF2 A 4.8 4.9 PCR Taqman PCV-2-F 5-TCACCTATGACCCCTATG-3 DB33/T 2269 2020 2 PCV-2-R-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-PCV-2-P-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-PCV-3-F-TGGCTCAACACATATGAC-PCV-3-R-ACGGACTTGTAACGAATC-PCV-3-P-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-4.10 1.5 mL 15 mL PCR 5 器材和 设备 5.1 5.2 5.3 12 000 r/min 5.4-5.5 PCR 5.6 5.7 5.8 6 实验室 分区 7 样品的 采集 与处 理 7.1 采样注 意事 项 7.2 采样工 具 2 h 7.3 采样方 法与 处理 7.3.1 内脏样 品 15 mL 1 4 0.01 mol/L PBS 3 3 000 r/min 20 min 1.5 mL 7.3.2 血清样 品 7.4 存放与 运送 DB33/T 2269 2020 3 6 h 8 h 2 8 24 h-80 3 8 核酸提 取 8.1 一般要 求 8.2 DNAzol 法 抽提 核酸 8.2.1 n 1.5 mL n 2 2 8.2.2 10 5 min 10 000 r/min 10 min 8.2.3 1.5 mL 1 mL DNAzol 5 8 1 min 3 min 5 000 r/min 5 min 8.2.4 1 mL 75%3 6 0.5 min 1 min 1 000 r/min 2 min 8.2.5-20 8.3 核酸提 取等 效方 法 9 实时荧 光PCR 检测 9.1 实时荧 光 PCR 扩 增体 系的 配制 9.1.1 9.1.2 PCR n n 2 2 1 表1 每个样 品反 应体 系配 制表 PCV-2-F PCV-2-R PCV-2-P PCV-3-F PCV-3-R PCV-3-P DEPC DB33/T 2269 2020 4 9.2 加样 9.2.1 9.2.2 PCR 8.2.5 2 L DNA 3 000 r/min 30 s 9.3 实时荧 光 PCR 扩增 9.3.1 9.3.2 9.2 PCR PCR 9.3.3 a)95 30 s b)95 5 s 60 30 s 40 60 9.4 荧光通 道设 定 PCV-2 Report Dye FAM Quencher Dye BHQ PCV-3 Report Dye HEX Quencher Dye BHQ 10 结果判 定 10.1 阈值设 定 10.2 质控标 准 FAM HEX Ct.0 FAM HEX Ct 10.3 结果描 述及 判定 10.3.1 FAM Ct 36.0 S PCV-2 FAM Ct PCV-2 FAM Ct 36.0 S Ct 38.0 PCV-2 PCV-2 10.3.2 HEX Ct 36.0 S PCV-3 HEX Ct PCV-3 HEX Ct 36.0 S Ct 38.0 PCV-3 PCV-3 DB33/T 2269 2020 5 A A 附 录 A（规范 性附 录）配制方 法 A.1 8 mmol/L NaOH 溶液 的配 制 0.32 g NaOH 1 000 mL A.2 0.01 mol/L PBS（pH 7.2）的配 制 Na2HPO4 12H2O)3.0 g KH2PO4 0.2 g KCl 0.2 g NaCl)8 g 1 000 mL 3 mol/L NaOH pH 7.2 121 2 15 min A.3 PCV-3 目的 基因（ORF2）序列 ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTATGCCAGAAGAAGACTATTCATTAGGAGGCCCACAGCTGGCACATACTACACAAAGAAATACTCCACCATGAACGTCATTTCCGTTGGAACTCCTCAGAATAATAAGCCCTGGCACGCCAACCACTTCATTACCCGCCTAAACGAGTGGGAAACTGCAATTAGCTTTGAATATTATAAGATACTAAAGATGAAAGTTACACTAAGCCCTGTAATTTCTCCAGCTCAGCAAACAAAAACTATGTTCGGGCACACAGCCATAGATCTAGACGGCGCCTGGACCACAAACACTTGGCTCCAAGACGACCCTTATGCGGAAAGTTCCACTCGTAAAGTTATGACTTCTAAAAAAAAACACAGCCGTTACTTCACCCCGAAACCAATTCTGGCGGGAACTACCAGCGCTCACCCAGGACAAAGCCTCTTCTTTTTCTCCAGACCCACCCCATGGCTCAACACATATGACCCCACCGTTCAATGGGGAGCACTGCTTTGGAGCATTTATGTCCCGGAAAAAACTGGAATGACAGACTTCTACGGCACGAAAGAAGTTTGGATTCGTTACAAGTCCGTTCTCTAA _