ICS 65.020.30 B41 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 2254 2020 猪流行性 腹泻病毒 与猪传染 性胃肠炎 病毒双重荧光 定量 RT-PCR 检测方 法 Method of duplex fluorescence quantitative RT-PCR for the detection of porcine epidemic diazhangchenrrhea virus and transmissible gastroenteritis virus 2020-04-08 发布 2020-05-08 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB33/T 2254 2020 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB33/T 2254 2020 1 猪 流行性 腹泻病毒 与猪传 染性胃肠 炎病毒 双重荧光 定量 RT-PCR 检测 方法 1 范围 Porcine epidemic diarrhea virus PEDV Transmissible gastroenteritis virus TGEV RT-PCR RT-PCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682-2008 3 缩略语 Ct Cycle threshold DEPC Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic Acid PBS Phosphate Buffered Saline PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus)RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TGEV Transmissible Gastroenteritis Virus 4 试剂和 材料 4.1 RNA 0.01 mol/L PBS DEPC GB/T 6682-2008 4.2 Trizol RNA 4.3 4.4 4.5 75%DEPC 4.6 DEPC A DEPC DNA RNA 4.7 0.01 mol/L PBS pH7.2 A DB33/T 2254 2020 2 4.8 2 One Step RT-PCR buffer PCR buffer dNTPs Mg2+4.9 DNA HS Taq DNA L 4.10 RNase 4.11 4.12 DEPC 4.13 RT-PCR 10 10 PEDV F 5-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG-PEDV R 5-ACGAACAGCCACATTACCACCAA-PEDV P 5-TTGGAGATGCGGAATTTGTCGAA-5 3 FAM MGB TGEV F 5-AAGGAAGATGGCGACCAGATAG-TGEV R 5-CACTTCTGATGGGCGAGCAT-TGEV P 5-CACGTTCACACACAAAT-5 3 HEX MGB 4.14 RT-PCR PCR 5 器材和 设备 5.1 5.2 5.3 12 000 r/min 5.4-5.5 PCR 5.6 6 实验室 分区 7 样品的 采集 与处 理 7.1 采样注 意事 项 7.2 采样工 具 7.2.1 2 h 7.2.2 7.3 采样方 法与 样品 处理 7.3.1 肠内容 物的 采集 与处 理 1 g2 g 15 mL 1 4 0.01 mol/L PBS 3 4 3 000 r/min 20 minDB33/T 2254 2020 3 1.5 mL 7.3.2 粪便的 采集 与处 理 15 mL 1 4 0.01 mol/L PBS 3 4 3 000 r/min 20 min 1.5 mL 7.3.3 细胞培 养物 处理 3 1.5 mL 7.3.4 样品存 放与 运输 6 h 8 h 2 8 24 h-80 3 8 核酸提 取 8.1 一般要 求 8.2 酚-氯 仿法 抽提 核酸 8.2.1 n 1.5 mL n 2 2 8.2.2 Trizol 100 10 5 min 200 5s 4 12 000 r/min 15 min 8.2.3 8.2.1 1.5 mL 500 8.2.2 500-20 30 min 8.2.4 4 12 000 r/min 15 min 600 75%8.2.5 4 12 000 r/min 15 min 8.2.6 4 000 r/min 10 s 3 min 10 min 8.2.7 30 DEPC RNA RNA 2 h RT-PCR-80 8.3 核酸提 取等 效方 法 9 荧光定 量 RT-PCR 检测 DB33/T 2254 2020 4 9.1 荧光 RT-PCR 扩 增体 系的 配 制 RT-PCR n n 2 2 1 表1 每个样 品反 应体 系配 制表 2 One Step RT-PCR buffer L HS Taq RT Enzyme Mix PEDV F PEDV R PEDV P TGEV F TGEV R TGEV P DEPC 9.2 加样 RT-PCR 8.2.7 3 000 r/min 30 s 9.3 荧光 RT-PCR 扩增 9.2 RT-PCR PCR a)30 min b)10 s c)5 s 30 s 40 9.4 荧光通 道的 设定 PEDV Report Dye FAM Quencher Dye MGB TGEV Report Dye HEX Quencher Dye MGB Reference None 10 结果判 定 10.1 阈值设 定 S DB33/T 2254 2020 5 10.2 质控标 准 FAM HEX Ct 30.0 S FAM HEX Ct 10.3 结果描 述及 判定 10.3.1 FAM Ct 36.0 S PEDV FAM Ct PEDV FAM Ct 36.0 S Ct 38.0 PEDV PEDV 10.3.2 HEX Ct 36.0 S TGEV HEX Ct TGEV HEX Ct 36.0 S Ct 38.0 TGEV TGEV DB33/T 2254 2020 6 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂配 制 A.1 0.01mol/L PBS（pH7.2）的配制 Na2HPO4 2O)3.0 g KH2PO4 0.2 g KCl 0.2 g NaCl)8 g 1 000 mL 3 mol/L NaOH pH 7.2 121 2 15 min A.2 DEPC 水 的配 制 0.1%DEPC 37 1 h 121 2 15 min _