I C S 6 5.0 2 0.3 0C C S B 4 1DB42湖 北 省 地 方 标 准D B 4 2/T 1 5 9 4 2 0 2 0猪 丹 毒（红 斑 丹 毒 丝 菌）P C R 鉴 别 诊 断 技 术规 程T e c h n i c a l p r o c e d u r e s o f P C R d i f f e r e n t i a l d i a g n o s i s f o r d e t e c t i o n o f v i r u l e n t a n da v i r u l e n t s w i n e e r y s i p e l a s(E r y s i p e l o t h r i x r h u s i o p a t h i a e)2 0 2 0-0 7-0 7 发 布 2 0 2 0-1 1-0 7 实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 4 2/T X X X X X 2 0 2 0I目 次前 言.I I引 言.I I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 与 定 义.14 检 测 原 理.15 检 测 条 件.16 检 测 方 法.27 结 果 判 定.28 注 意 事 项.2附 录 A（规 范 性 附 录）试 剂 的 配 制.3D B 4 2/T X X X X X 2 0 2 0I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 给 出 的 规则 起 草。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口 管 理。本 文 件 起 草 单 位：华 中 农 业 大 学、武 汉 科 前 生 物 股 份 有 限 公 司。本 文 件 主 要 起 草 人：金 梅 林、吴 超、朱 伟 峰、孙 小 美、范 俊 青、康 超、徐 高 原。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问，可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅，联 系 电 话：0 2 7-8 7 6 6 5 8 2 1，邮 箱：h b s n a b 1 2 6.c o m；华 中 农 业 大 学，联 系 电 话：0 2 7-8 7 2 8 2 0 3 8，邮 箱：x y s m a i l.h z a u.e d u.c n。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学，电 话：0 2 7-8 7 2 8 6 9 0 5，邮 箱：j m l 8 3 2 8 1 2 6.c o m。D B 4 2/T X X X X X 2 0 2 0I I I引 言猪 丹 毒 是 一 种 重 要 的 人 畜 共 患 病，由 红 斑 丹 毒 丝 菌（俗 称 猪 丹 毒 杆 菌）引 起。猪 丹 毒 可 导 致 生 猪 从业 人 员 中 的 特 定 人 群 感 染 和 死 亡，严 重 危 害 人 类 健 康，同 时 给 我 国 养 猪 业 造 成 巨 大 经 济 损 失。为 此，制定 了 猪 丹 毒（红 斑 丹 毒 丝 菌）P C R 鉴 别 诊 断 技 术 规 程 标 准，建 立 了 一 种 既 可 以 鉴 定 红 斑 丹 毒 丝 菌 临床 分 离 株 又 可 以 同 时 区 分 疫 苗 菌 株 和 野 生 型 菌 株 的 双 重 P C R 方 法，有 利 于 该 病 的 早 发 现、早 报 告、早 处置，为 防 控 节 省 时 间，为 猪 丹 毒 的 快 速 诊 断、猪 丹 毒 野 生 毒 株 与 疫 苗 弱 毒 株 的 鉴 别 诊 断 提 供 了 精 确 简 便的 分 子 生 物 学 方 法，对 当 前 防 控 猪 丹 毒 具 有 重 大 意 义。D B 4 2/T X X X X X 2 0 2 01猪 丹 毒（红 斑 丹 毒 丝 菌）P C R 鉴 别 诊 断 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 猪 丹 毒（红 斑 丹 毒 丝 菌）P C R 鉴 别 诊 断 技 术 的 术 语 与 定 义、检 测 原 理、检 测 条 件、检测 方 法、结 果 判 定 等。本 文 件 适 用 于 猪 丹 毒（红 斑 丹 毒 丝 菌）的 鉴 别 诊 断。2 规 范 性 引 用 文 件本 文 件 没 有 规 范 性 引 用 文 件。3 术 语 与 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准3.1双 重 P C R 法 d u p l e x P C R指 在 同 一 P C R 反 应 体 系 里 加 入 两 对 引 物，针 对 两 个 D N A 模 板 或 者 同 一 个 D N A 模 板 的 两 个 不 同 区 域 进 行扩 增，最 多 可 同 时 扩 增 出 两 条 核 酸 片 段 的 P C R 反 应。4 检 测 原 理利 用 红 斑 丹 毒 丝 菌 弱 毒 疫 苗 株 G 4 T 1 0 和 G C 4 2 与 野 毒 株 关 于 D N A 聚 合 酶 I V 基 因 上 的 差 异，设 计 猪 丹 毒 疫苗 株 的 特 异 性 引 物，结 合 猪 丹 毒 杆 菌 的 种 特 异 性 引 物，建 立 起 一 种 快 速 检 测 猪 丹 毒 菌 株 并 同 时 区 分 猪 丹毒 弱 毒 疫 苗 株 和 野 毒 株 的 双 重 P C R 法。5 检 测 条 件5.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 室 温 下 进 行。5.2 仪 器 及 耗 材P C R 仪、琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仪、组 织 研 磨 仪、凝 胶 成 像 系 统、电 磁 炉、微 量 移 液 器（0.1 L-2.5 L、0.5 L-1 0 L、5 L-5 0 L、1 0 L-1 0 0 L、1 0 0 L-1 m L）、离 心 机（1 2 0 0 0 r p m）、恒 温 箱（3 7）、水浴 锅（5 5-6 0）、电 子 天 平（0.0 1 g-3 0 0 g）离 心 管（0.2 m L、1.5 m L）5.3 试 剂D B 4 2/T X X X X X 2 0 2 02D N A 聚 合 酶 E a s y T a q、E a s y T a q 1 0 b u f f e r、d N T P s、去 离 子 水、D N A M a r k e r（包 含 5 0 0 b p，1 0 0 0 b p条 带）、阳 性 对 照 1、阳 性 对 照 2、阴 性 对 照、蛋 白 酶 K（1 0 0 g/m L）、G o l d V i e w 核 酸 染 料、溴 酚 蓝 上样 缓 冲 液、琼 脂 糖 凝 胶（1 0 g/L）、P B S 缓 冲 液、T A E 电 泳 缓 冲 液、引 物。6 检 测 方 法6.1 样 品 准 备采 集 发 病 猪 的 心、肺、肾、肝、脾、脑 及 关 节 样 品 组 织，将 0.5 g 样 品 组 织 剪 碎 加 入 2 m L P B S 匀 浆，匀 浆 操 作 时 间 3 0 秒，共 3 次。于 3 7 培 养 5 h，加 蛋 白 酶 K（1 0 0 g/m L）于 5 5-6 0 水 浴 1 h。取 1 m L 消 化 产物 于 离 心 管 中，沸 水 中 加 热 5 m i n 并 快 速 置 于 冰 浴 中 5 m i n，1 2 0 0 0 r p m 离 心 2 m i n，取 上 清 即 为 样 品 D N A。6.2 P C R 扩 增以 提 取 的 样 品 D N A 为 模 板 进 行 P C R 反 应。P C R 反 应 体 系（2 5 L）：引 物 v a c c i n e-F 2 0 m o l/L 1 L，引 物 v a c c i n e-R 2 0 m o l/L 1 L，E R 1 2 0 m o l/L1 L，E R 2 2 0 m o l/L 1 L，d N T P s 2 L，E a s y T a q 0.5 L，E a s y T a q 1 0 b u f f e r 2.5 L，去 离 子 水 1 5 L，样 本 D N A 1 L。P C R 反 应 条 件：1：9 4 2 m i n；2：9 4 3 0 s e c；3：5 5 3 0 s e c；4：7 2 1 m i n；5：7 2 2 m i n，其 中 2，3，4 循 环 3 5 次。6.3 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳P C R 反 应 扩 增 完 成 后，向 产 物 中 加 入 0.1%的 溴 酚 蓝 上 样 缓 冲 液。使 用 1 倍 T A E 电 泳 缓 冲 液 配 制 1 0 g/L的 琼 脂 糖 凝 胶，凝 胶 中 加 入 0.0 0 5%的 G o l d V i e w 染 料 进 行 染 色。电 泳 完 成 后 于 凝 胶 成 像 系 统 下 观 察。7 结 果 判 定阳 性 对 照 1 扩 增 出 4 5 3 b p 片 段 和 9 3 7 b p 片 段，阳 性 对 照 2 扩 增 出 9 3 7 b p 片 段，阴 性 对 照 不 能 扩 增 出 任 何片 段，判 定 为 检 测 结 果 成 立，否 则 判 定 为 检 测 结 果 不 成 立。在 试 验 结 果 成 立 的 前 提 下，同 时 扩 增 出 4 5 3 b p 和 9 3 7 b p 片 段，判 定 为 猪 丹 毒 疫 苗 株；仅 扩 增 出 9 3 7 b p片 段，判 定 为 猪 丹 毒 野 毒 株。8 注 意 事 项采 样 及 检 测 过 程 中 应 注 意 个 人 防 护，戴 口 罩 和 手 套、穿 工 作 服；在 无 污 染 环 境 中 操 作，及 时 清 理 物品，用 7 5%酒 精 对 操 作 区 域 消 毒 处 理；废 弃 物 经 高 压 灭 菌 后 按 有 关 规 定 处 理。D B 4 2/T X X X X X 2 0 2 03A A附 录 A（规 范 性）试 剂 的 配 制A.1 商 品 化 试 剂D N A 聚 合 酶 E a s y T a q、E a s y T a q 1 0 b u f f e r、d N T P s、去 离 子 水、蛋 白 酶 K、琼 脂 糖、溴 酚 蓝 上 样 缓 冲液、G o l d V i e w 染 料，均 为 商 品 化 试 剂。A.2 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照阳 性 对 照 1：红 斑 丹 毒 丝 菌 G 4 T 1 0 疫 苗 株 全 基 因 组 D N A阳 性 对 照 2：红 斑 丹 毒 丝 菌 1 a 型 标 准 强 毒 C 4 3-8 株 全 基 因 组 D N A阴 性 对 照：去 离 子 水。A.3 P B S 缓 冲 液氯 化 钠（N a C l）8 g，氯 化 钾（K C l）0.2 g，十 二 水 磷 酸 氢 二 钠（N a2H P O4 1 2 H2O）2.9 g，磷 酸 二 氢钾（K H2P O4）0.2 g，加 水 至 1 0 0 0 m L，置 2-8 保 存 备 用。A.4 T A E 电 泳 缓 冲 液5 0 倍 T A E 缓 冲 液 制 备：称 取 T r i s 盐 2 4 2 g，N a2E D T A.2 H 2 O 3 7.2 g 溶 于 约 6 0 0 m L 的 去 离 子 水，充 分 搅 拌溶 解；加 入 5 7.1 m L 的 醋 酸，充 分 搅 拌；加 去 离 子 水 将 溶 液 定 容 至 1 L 后，室 温 保 存。A.5 琼 脂 糖 凝 胶（1 0 g/L）称 取 1 g 琼 脂 糖，加 入 1 倍 的 T A E 电 泳 缓 冲 液 1 0 0 m L，微 波 炉 中 加 热 至 琼 脂 糖 完 成 溶 解。A.6 引 物 序 列v a c c i n e-F：5 A G T G A T G A A A C T G A T T C G T G C T C 3，v a c c i n e-R：5 G C C T A A A T T A A A C C A C T T G C A C A C A 3，E R 1：5 C G A T T A T A T T C T T A G C A C G C A A C G 3，E R 2：5 T G C T T G T G T T G T G A T T T C T T G A C G 3。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _