ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 4047 2020 猪圆环病 毒 3 型聚合酶链式 反应检测 方法 Detecting porcine circovirus 3 with polymerase chain reaction 2020-07-09 发布 2020-08-09 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 4047 2020 I 前 言 GB/T 1.1 2009 DB37/T 4047 2020 1 猪 圆环病 毒 3 型聚 合酶链 式反应检 测方法 1 范围 3 Porcine Circovirus Type 3 PCV3 Polymerase Chain Reaction PCR 3 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 NY/T 541 2016 3 原理 Polymerase Chain Reaction PCR DNA PCR dNTP DNA-25 30 109 2 min 4 min 2 h 3 h 4 试剂和 材料 4.1 GB/T 6682 4.2 K 20 mg/mL A.1 4.3 10%SDS pH7.2 A.2 4.4 Tris 4.5 4.6 4.7 70%A.3 4.8 0.5 TBE A.4 4.9 1%A.5 4.10 DNA 4.11 DNA Marker 2000 4.12 P1 5-TACCACAGAAGGCGCTATGTCG-3 DB37/T 4047 2020 2 P2 5-ATCCGCATAAGGGTCGTCTTGC-3 5 仪器设 备 5.1 0.001 g 5.2 10 L 20 L 100 L 1 000 L 5.3 5.4 PCR 5.5 5.6 5.7 6 样品 6.1 样品采 集 NY/T 541 2016 6.2 样品处 理 6.2.1 DNA 6.2.2 1 g 1:5 3 5 000 g 15 min-20 7 操作步 骤 7.1 病毒DNA 的 提取 7.1.1 500 L 10%SDS 50 L 20 mg/mL K 10 L55 2 h 3 h 7.1.2 200 L Tris 4 12 000 g 15 min 7.1.3 500 L 200 L Tris 200 L 4 12 000 g 15 min 7.1.4 400 L 200 L 4 12 000 g 15 min 7.1.5 300 L 2-20 20 min 4 12 000 g 15 min 7.1.6 1 mL 70%7.1.7 20 L-20 7.2 聚合酶 链式 反应（PCR）操 作流程 7.2.1 PCR 反 应体 系配 制 1 1-7 表1 聚合酶 链式 反应 体系 1 5.0 2 dNTP(10 mmol/L)4.0 DB37/T 4047 2020 3 表1 聚合 酶链 式反 应体 系 3 P1(10 1 4 P2(10 5 DNA 4 6 TaqDNA(8)1.0 7 50.0 7.2.2 PCR 程 序设 定 PCR 2 表2 PCR 反 应程 序设 定 1 94 4 min 2 94 20 s 3 50 30 s 4 72 1 min 5 2 4 40 6 72 5 min 7.3 电泳操 作 100 V 40 min DNA DNA 8 结果分 析和 判定 330 bp 330 bp 3 3 9 试验材 料处 理 9.1 病料的 无害 化处 理 PCV3 9.2 试验材 料处 理 PCR DB37/T 4047 2020 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂的 配制 A.1 蛋白酶K溶液(20 mg/mL)K 100 mg 5 mL A.2 10%十 二烷 基硫 酸钠(SDS 溶液，pH7.2)10 g 80 mL pH 7.2 100 mL A.3 70%乙醇 70 mL 30 mL A.4 0.5TBE 缓 冲液 Tris 108 g Na2EDTA.2H2O 7.44 g 55 g 1 L 10 TBE 10 TBE 25 mL 475 mL 0.5 A.5 电泳 级1%琼脂 糖 0.6 g 0.5 TBE 60 mL _