1 ICS 65.020 B 62 备案号：DB42 湖北省 地 方 标 准 DB42/T 1448 2018 蝴蝶兰组 培苗工厂 化生产技 术规程 Code of practice for tissue culture of phalaenopsis seedling in industrial production（报批稿）2018-09-11 发布 2018-12-10 实施 湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB42/T 14482018 I 目 次 前言.III 1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 术语 与定 义.1 3.1 组 培苗 in vitro plantlet.1 3.2 中苗 medium sized plantlet.1 3.3 成 品苗 the finished product plantlet.1 4 设施 条件.1 5 培养 基配 制.2 5.1 水 质要 求.2 5.2 培 养基 配制 及分 装.2 5.3 培 养基 灭菌.2 5.4 培 养基 储存.2 6 组织 培养 操作 方法.2 6.1 操 作前 准备.2 6.2 外 植体 选择 与消 毒.2 6.3 增 殖与 继代 培养.3 6.4 壮 苗培 养.3 6.5 生 根培 养.3 6.6 接种.4 7 组培 苗培 养管 理.4 7.1 组 培苗 摆放.4 7.2 培 养条 件.5 8 炼苗 与移 栽.5 9 报损 预防.5 9.1 预 防原 则.5 9.2 降 低污 染.6 10 包 装、标识 和储 运.6 10.1 包装.6 10.2 标识.6 10.3 储运.6 11 生产 档案.7 11.1 档 案记 录要 求.7 11.2 档 案管 理要 求.7 DB42/T 14482018 II DB42/T 14482018 III 前 言 本标准 按 照 GB/T 1.1-2009 标准 化工 作导 则 第 1 部 分：标 准的 结构 和编 写 给出的 规则 起草。本标准 由 武 汉市 农业 科学 院提出。本标准 由 湖 北省 农业 科学 院归口。本标准 起草 单位：武 汉市 农业科 学院 作物 研究 所、武汉维 尔福 生物 科技 股份 有限公 司。本标 准 主要 起草 人：张 娜、任 俭、曾红 霞、汤 谧、孙玉 宏、王 蕾、程维 舜、杨皓 琼、陈 伟、高红霞、熊 建顺。DB42/T 14482018 1 蝴 蝶兰组 培苗工厂 化生产 技术规程 1 范围 本 标准 规定 了蝴 蝶兰（Phalaenopsis spp.）组培 苗工厂 化生 产 的 术语 与定 义、设 施条 件、培养 基配制、组 织培 养操 作方 法、组培苗 培养 管理、炼 苗移 栽、报 损预 防、包装、标 识和储 运 及 生产 档案。本标准 适用 于湖 北区 域相 似工厂 化生 产条 件下 蝴蝶 兰组培 苗的 生产。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。NY/T 2306-2013 花卉 种 苗组培 快繁 技术 规程 DB42/T 1116-2015 观 赏 花卉 蝴蝶 兰盆 花设 施栽 培 生产技 术规 程 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 组培苗 in vitro plantlet 在无菌 和人 工条 件下 通过 植物组 织培 养技 术获 得的 各规格 试管 苗。3.2 中苗 medium sized plantlet 经组织 培养 形成 的叶 色正 常、株 高 在1 cm 2 cm 的健壮组 培苗。3.3 成品苗 the finished product plantlet 经组织 培养 形成 的叶 色正 常、株高 在2.5 cm 以上、具 有2条 3条根、经 炼苗 后 可出瓶 移栽 的健 壮组培苗。4 设施条 件 DB42/T 14482018 2 选址、设计 要求、设 备器 材及试 剂参 照 NY/T 2306-2013 中 的相 关要 求 合 理配 备。5 培养基 配制 5.1 水质要 求 培养基 配制 用水 水质 应符 合NY/T 2306-2013 表B.1（续）的 要求。5.2 培养基 配制 及分 装 根据不 同品 种和 不同 培养 阶段要 求配 制不 同种 类的 培养基，培 养基 主要 成分 和 化学试 剂的 质量 控 制参照NY/T 2306-2013的 要 求。定 容后 搅拌 均匀，以0.1 mol/L 的NaOH、HCl溶液 或其 他有 效溶 液调整pH值后，根据 不同 培养 要求 每培养 瓶分 装100 ml 120 ml，标明编号、配 制日 期 等信息。5.3 培养基 灭菌 高温高 压灭 菌压 力9.8 104 Pa 10.8 104 Pa，温度（121 2），灭 菌时 间15 min 25 min。5.4 培养基 储存 灭菌后 的培 养基 按编 号归 类层叠 堆放，平 置冷 却。培养基 存储 温度 不高 于25，尽 量避 光避 粉 尘，存储时 间 不 超过30 d。6 组织培 养操 作方 法 6.1 操作前 准备 接种前 打开 超净 工作 台的 紫外 灯 30 min，灭菌 完后 打开风 机 20min，风 速 20 m/min 30 m/min。操作人员 进入 无菌 室前 首先 清洗双 手，再换 上个 人专 用的制 服、鞋帽。操 作台 及器具 表面 用 75%酒精或其他有 效消 毒溶 液擦 拭消 毒，操 作台 内不 放不 必要 的物品。6.2 外植体 选择 与消 毒 6.2.1 外植体 选择 符合市 场需 求和 消费 习惯 的蝴蝶 兰品 种，要求 观赏 性状好、生 长健 壮、无病 虫害、花期 长。根 据 需要取蝴 蝶兰 成熟 果荚、幼 嫩花梗 等部 位。6.2.2 外植体 消毒 与接 种 6.2.2.1 果荚消 毒 与 接种 DB42/T 14482018 3 以清水 洗净 果荚 表面 灰尘，后用 流水 将其 冲洗10 min 30 min，再在 操作 台上 以75%酒精 擦拭1 遍，切除果 柄，以2%的NaClO 溶液消毒20 min30 min 或其他 有效 消毒 溶液 消毒 后，以 无菌 水清 洗4 次5次。用 无菌 解剖 刀将 果荚 两端 尖头部 分切 除，再 纵向 剖 开，将种子 接 种于 培养 瓶，均匀分 布于 培养 基表面，封 好瓶 口后 进行 培养。6.2.2.2 花梗消 毒 与 接种 花梗 取 回后 先以 清水 洗净 表面灰 尘，再在 操作 台上 以75%酒精 擦拭1 遍，切成5 cm 左右的花 梗 段，用2%的NaClO 溶 液或 其他 有效 消 毒溶 液进行2 次消 毒：第 一次 放入 盛有 足量 消 毒溶液、经高 温高 压灭 菌的玻璃 器皿 中消 毒，消毒 时间根据 花 梗成 熟性 而定，一般8 min 40 min，后 以无菌 水清 洗4 次5 次；第二次 用高 温消 毒后 的镊 子剥除 包被 腋芽 的苞 叶，露出腋 芽，再用 消毒 溶液 消毒6 min 9 min，以 无 菌水清洗4次 5次。消毒完 成的 带腋 芽花 梗斜 切成1 cm 1.5 cm 的花梗 段，插入 相应 培养 基，使 腋 芽垂直 于培 养基 向上且不接 触培 养基，每 培养 瓶接种3个 4个 花梗 段，封好瓶 口后 进行 培养。培养基 为MS+0.5 mg L 3 mg L 6-BA+0 mg L 0.5 mg L NAA+20 g/L 蔗糖+7 g L 8 g L琼脂，pH 值为5.2 5.8。6.3 增殖与 继代 培养 外植体 接种 后30 d 60 d 进 行增殖 培养，30 d 60 d后进 行继 代培 养。继 代、增 殖 培养基 为MS+2 mgL 5 mg L 6-BA+0.3 mg L 1.5 mg L NAA+0 g L 2 g/L 活性炭+20 g/L 蔗糖+7 g L 8 g L琼脂，pH 值为5.2 5.8。6.4 壮苗培 养 继代培 养后 达到1 cm 以上 的芽苗 可根 据需 要分 成单 株进行 壮苗 培养。壮 苗培 养基为MS+20 g L 蔗糖+7 g L 8 gL 琼脂+1 g L 2 g/L 活性炭，pH 值为5.2 5.8。6.5 生根培 养 壮苗培 养后，剔 除变 异苗 及细弱 苗，挑选 茎段 长度 为1.5 cm 左右、叶长2.5 cm 左右，且生 长健 壮、长势一 致的 无根 苗进 行生 根培养。生 根培 养基 为MS+0.1 mg L 1 mg L IBA+0.1 mg L 1 mg L NAA+15 g L 20 g/L 蔗糖+7 g L 8 g L 琼脂+1 g L 2 g/L 活性炭，pH 值为5.2 5.8。DB42/T 14482018 4 6.6 接种 6.6.1 接种方 法 接种首 先 去 除表 面附 着的 培养基、不正 常组 织，再 将 培养物 按不 同要 求进 行分 切操作，并 接 种于 不同培养 基。夹苗 时手 要轻，按规 定操 作，接种 时按 由内向 外顺 序进 行，外围 芽距离 瓶壁 0.3 cm 左右，叶片不 接触 瓶壁。接 种装 瓶时芽 的大小、接种 深度 和数量 等应 符合 6.6.2 的 规 定。6.6.2 装瓶要 求 按实生 苗和 分生 苗进 行装 瓶，具 体要 求如 下：a）实 生苗：播 种：芽 球，35 棵/瓶40 棵/瓶，均 匀分 布。中母瓶：35 株/瓶，要 求：中 间 20 株，外围 15 株，株高 2 cm 以下，大 小均 匀。成 瓶：22 株/瓶，要 求：中 间 10 株，外围 12 株，株高 2 cm 以上，均 匀分 布，大 小一 致。b）分 生苗：切 芽：25 株/瓶，要求：中间 13 株，外 围 12 株，接种 深 度在 芽 的 1/3 处，株高 2 cm 左右。35 株/瓶，要 求：中间 20 株，外 围 15 株，接种深 度在 芽的 1/3 处，株 高 1 cm 2 cm。中母瓶：24 株/瓶，要 求：中 间 12 株，外围 12 株，中间 稍微 可比 外围 大，株高 2 cm 左右。成 瓶：11 株/瓶，要求：最 内 1 株，中间 3 株，最外 围 7 株，株高 2.5 cm 以上。16 株/瓶，要求：最内 2 株，中间 5 株，最外 围 9 株，株高 2 cm 2.5 cm。6.6.3 封口 做好的 产品 盖上 盖子，写 好日期、编 号、操 作员 代号 等，填 写接 种日 记录 后，搬 到指定 培养 室 培 养。6.6.4 注意事 项及 安全 管理 接种注 意事 项及 接种 操作 的安全 管理 按照NY/T 2306-2013中10.5 接种 的相 关规 定 执行。7 组培苗 培养 管理 7.1 组培苗 摆放 DB42/T 14482018 5 组 培 苗 在无 菌 操作 间 完成后，放 于统 一 规格 的 托盘，运 至 组培 苗 培养 间，根据 要 求 分类 整 齐摆 放于培养 架上。7.2 培养条 件 组培苗 培养 间由 专人 负责 温度、湿度、光照 强度 等培 养条件 的监 控、记录 和调 整，每 日上 午、下 午、晚间各 调查 记 录2次，及 时 作出调整。7.2.1 温度调控 蝴蝶兰 组培 苗 适 宜的 生长 温度 为 24 28。具体 控温 要求：a)母瓶 培养 间，24 28，冬 季允 许 在此 标准 下 调 1 2；b)丛生 芽培 养间，25 27，冬 季允 许在 此标 准 下调 1 2；c)中苗 培养 间，24 29，冬 季允 许 在此 标准 下 调 1 2；d)成品 苗培 养间，25 27，冬 季允 许在 此标 准 下调 1 2。7.2.2 湿度调控 培养间 相对 湿度 宜为 60%左右，超 过 60%抽湿 降湿。7.2.3 光照调控 培养间 光照 宜控 制 在 18 mol m-2 s-163 mol m-2 s-1。母 瓶培 养 间 和丛 生芽 培 养间光 照强 度宜 为 18 mol m-2 s-136 mol m-2 s-1；中苗 培养 和成 品苗 培养 间 36 mol m-2 s-163 mol m-2 s-1。光照时间宜为8 h/d 16 h/d，新 接种 的甁 苗在 3 d 7 d 内 避光 培养。根 据不 同品 种特 性适 当 调节光 照强 度和 光照 时 间。8 炼苗与 移栽 经组织 培养 形成 的无 污染、生长 健康、株高2.5 cm 以上，且 具有3片 4片 叶、2 条4 条健 壮根 的 组培苗可 进行 炼苗 移栽。炼 苗 和移栽 按照DB42/T 1116-2015 观 赏花 卉 蝴蝶 兰盆 花 设施栽 培生 产技 术规 程中5栽 培管 理规 定的 方法 进 行。9 报损预 防 9.1 预防原 则 报损主 要有 培养 物污 染和 培养瓶 破损 两种，应 加强 管理，预防 为主。DB42/T 14482018 6 9.2 降低污 染 9.2.1 严格操 作规 程 灭菌消 毒、接种 操作、培 养管理 等整 个生 产过 程符合NY/T 2306-2013中 的相 关规定。9.2.2 环境及 器具 消毒 每7 d 对 工作 服、口 罩、帽 子等布 质品进 行湿 热灭菌（最好 使用一 次性 口罩和 帽子）。每个 月清洗或更换 超净 工作 台初效 过 滤器，并对 台面 进行 消毒。每1 个月 3个月 对 接种 室与培 养室 进行 消毒。已污染 的组 培瓶 经高 温高 压灭菌 后再 清洗；培 养容 器、封 口材 料等 器具 在使 用前严 格清 洗和 消 毒；灭菌前 检查 灭菌 锅的 使用 情况，发现 问题 立即 检修；灭菌 过程 保证 应达 到的 压力、时间，压 力 表 降 到 零后不能 马上 出锅，防 止外 界冷空 气倒 吸引 起污 染。10 包装、标识 和 储 运 10.1 包装 包装基 本参 照 NY/T 2306-2013 中 规定 的方 法进 行，具体细 节根 据实 际情 况进 行适当 调整。10.1.1 带瓶包 装 提前挑 除污 染及 不合 要求 的产品。用 气泡 棉将 成品 瓶装好，以 胶带 封口，放 入合适 规格 的包 装 箱，层与层 之间 及顶 层用 泡沫 棉隔开，胶 带封 箱，塑 带 绑定。注明 品种、装箱 数 量及日 期、产品 说明、注 意事项等 信息。10.1.2 裸根苗 包装 用镊子 将组 培苗 从培 养瓶 中取出，不要 伤及 叶片 和 根部；去 除附 着的 培养 基，剔除畸 形叶 片或 黄叶超过3片、根 系不健 康的 组 培苗；每组25 株，装入包 装盒，注意不 要扭 曲、弄 伤叶片 和根；盒外 用保 鲜膜轻裹；封 箱方 法同10.1.1。10.2 标识 包装箱 外 应 注明 产品 名称、品种 名、花色、质 量等 级、产 品数 量、产地、生 产单位、包 装日 期、包装储运 图示 标志 等。10.3 储运 DB42/T 14482018 7 装运 储 存的 场所 和运 输过 程宜保持18 20。11 生 产档 案 11.1 档案 记录 要求 建立 蝴 蝶兰 组培 苗 生 产档 案，主 要包 括日常 温 度、湿度、光照 及接 种人 员、时间，对生 产技 术 各 环节所采 取的 措施 进行 详细 记录。11.2 档案 管理 要求 建立种 苗质 量可 追溯 制度，有 专人 管理，确保 覆盖 整 个生产 管理 周期 的档 案资 料齐全，种苗 来源 清楚、去 向明 确。所有 记录 真实、准确、规 范，档案 保存期 限不 少于2年。_ _