ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB 37/T 4362 2021 流感病毒 与犬瘟热 病毒双重 荧光 RT-PCR 检测方法 Duplex real-time RT-PCR detection method for influenza virus and canine distemper virus 2021-03-11 发布 2021-04-11 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB 37/T 4362 2021 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB 37/T 4362 2021 1 流 感病毒 与犬瘟热 病毒双 重荧 光 RT-PCR 检测方 法 1 范围 RT-PCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 GB/T 27401 3 术语和 定义 4 缩略语 RT-PCR RNA PBS 5 试剂或 材料 5.1 GB/T 6682 RNA 5.2 TRIzol 2 8 5.3 0.1%DEPC 5.4 4 5.5 4 5.6 75%A.3-20 5.7 TE A.4 5.8 M N DB 37/T 4362 2021 2 6 仪器设 备 6.1 PCR 6.2 13 000 r/min 6.3 2 8-20 6.4 5 L 10 L 100 L 1 000 L 6.5 1.5 mL 7 样品 7.1 采样工 具 121 15 min 1.5 mL 7.2 样品采 集 7.2.1 拭子样 品 a)3 5 1.0 mL PBS 1.5 mL b)1.0 mL PBS 1.5 mL 7.2.2 组织样 品 2.0 g 7.3 样品贮 运 24 h 7.4 样品处 理 7.4.1 拭子样 品 30 min 7.4.2 组织样 品 2.0 g 10 mL PBS 4 3 000 r/min 15 min 1.5 mL DB 37/T 4362 2021 3 7.5 样品贮 存 2 8 24 h-70 7.6 其它样 品说 明 8 实验步 骤 8.1 实验室 规范 RT-PCR GB 19489 GB/T 27401 RNA 250 4 h RNA 8.2 样品病 毒核 酸RNA 提取 RNA RNA 8.2.1 1.5 mL 200 L TRIzol 1 mL 10 min 8.2.2 200 L 10 min 8.2.3 4 13 000 r/min 15 min 8.2.4 10 min 8.2.5 4 13 000 r/min 15 min 8.2.6 1.0 mL 75%4 8 000 r/min 10 min,5 min 8.2.7 50 LTE RNA-20 8.2.8 RNA RNA 8.3 双重荧 光 RT-PCR 扩增 8.3.1 扩增试 剂准 备 PCR n n=+1+2 20 L RT-PCR B.2 n+1 PCR 20 L 8.3.2 加样 PCR 8.2.7 RNA 5 L 500 r/min 30 8.3.3 荧光 RT-PCR 反应 PCR PCR 42/15 min 94/3 min 94/15 sec 55/10 sec 60/30 sec 40 40 2 min 60 DB 37/T 4362 2021 4 9 结果判 定 9.1 结果分 析条 件的 设定 PCR FAM Cy5 9.2 质控标 准 9.2.1 Ct 9.2.2 Ct 28 C 9.2.3 注：Ct 9.3 结果判 定 9.3.1 阴性 Ct 9.3.2 阳性 9.3.2.1 Ct 30.0 9.3.2.2 FAM Ct 30.0 Cy5 Ct Cy5 Ct 30.0 FAM Ct 9.3.3 可疑 Ct 30.0 38.0 DB 37/T 4362 2021 5 A A 附录A（资料 性）溶液配 制 A.1 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液 6.055 g Tris 100 mL 80 mL 0.1%DEPC HCl pH 8.0 100 mL A.2 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液 18.61 g Na2EDTA 2H2O 100 mL 80 mL 0.1%DEPC 10%NaOH pH 8.0 100 mL A.3 75%乙醇 75 mL 25 mL 0.1%DEPC A.4 TE 缓 冲液 0.5 mL 10 mmol Tris-HCl(pH8.0)0.1 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)pH8.0 0.1%DEPC 50 mL 4 DB 37/T 4362 2021 6 B B 附录B（资料 性）引物探 针序 列及 荧 光RT-PCR 反 应液 配方 B.1 引物和 探针 B.1 表B.1 引物和 探针 序列 表 ACCAGTCAACAAACTCCACAG GATTTGTTGCACACAGCATTCC FAM-GATTTGTTGCACACAGCATTCC-BHQ GCAAGCGAGGATTGAGGGTAT GGCCTATGGGACACACTCAAA Cy5-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ B.2 荧光 RT-PCR 反 应液 配方 RT-PCR B.2 表B.2 荧光 RT-PCR 反 应液 配方 1 5 RT 5.0 L M-MLV(200 U/)0.5 L dNTPs(10 mmol/L)1.0 L MgCl2(25 mmol/L)3.0 L(10 0.5 L(10 0.5 L(10 0.5 L(10 0.5 L(10 0.5 L(10 0.5 L RNA(40 U/0.25 L Ex Taq HS(40 U/0.25 L DEPC 7.0 L 20 L DB 37/T 4362 2021 7 C C 附录C（资料 性）对照样 品检 测结 果曲 线图 C.1 图C.1 流感病 毒阳性 对照 曲 线图 C.2 图C.2 犬瘟热 病 毒 阳性 对照 曲线 图