ICS 65.020.30 CCS B 41 1301 石家庄市地方标准 DB 1301/T 361 2020 蜜蜂微孢 子虫病防 治技术规 程 2020-12-10 发布 2020-12-31 实施 石家庄市 市场监 督 管理局 发 布 DB 1301/T 361 2020 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 诊 断与 鉴定.1 诊断 流程.1 症状.1 实验 室鉴 定.2 取样.4 5 防控.4 蜂场 场址 选择.4 饲养 管理.4 监测.4 防治.5 附录A（规 范性）PCR 反 应体系 及引 物序 列.6 A.1 PCR 反应 体系.6 A.2 引物 序列.6 DB 1301/T 361 2020 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由 石 家庄 市农 业农 村局 提 出。本文件 起草 单位：石家 庄 市动物 疫病 预防 控制 中心、中 国农 业科 学院 蜜蜂 研 究所、石 家庄 赞皇 县蕊源蜂业 有限 公司。本文件 主要 起草 人：王 强、王荣申、陈海 军、武瑞 栓、王岳森、郭伟 婷、张伟 涛、王岳峰、许亚 改、吕洁、周文茂、曹 莉、孙 海红、张一伟、王 聪敏、席立朋、翟可、韩 扶民、韩宁凯、邢伟 山、杨双学。DB 1301/T 361 2020 1 蜜蜂微孢 子虫病 防治技术 规程 1 范围 本文件 规定 了蜜 蜂微 孢子 虫病诊 断与 鉴定、防 控的 方法。本文件 适用 于蜜 蜂微 孢子 虫病症 状、形态 及分 子生 物学诊 断和 综合 防治。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 19168 蜜 蜂病 虫害 综合防 治规 范 SN/T 1683 蜜 蜂微 孢子 虫 病诊断 方法 OIE 陆生 动物 卫生 法典 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。蜜蜂 微 孢子 虫 是 一 种 侵染 成 年蜜 蜂 中肠上 皮 细 胞引 起 蜜蜂 发 病的致 病 性 真菌，包括 蜜 蜂微孢 子 虫 和东 方 蜜蜂 微孢子2 个种。消毒 指 为 杀 灭包 括 蜜蜂 疫 病病原 体 或 寄生 虫 而采 取 的一种 措 施，适 用 于可 能 曾被直 接 或 间接 污 染的 场所、工 具及 各种 物体 来源：OIE 陆 生动 物卫 生 法典，总论 之术 语表，有 修改 监测 指系统 而持 续地 收集、整 理和分 析与 蜜蜂 微孢 子虫 病有关 的信 息，并及 时向 相关人 士传 递信 息以 便采取相 应行 动的 措施。来源：OIE 陆 生动 物卫 生 法典，总论 之术 语表，有 修改 4 诊断与 鉴定 诊断流 程 当 观 察 到蜂 群 出现 典 型症状 时 应 遵循 先 通过 个 体症状 观 察 初步 确 诊，再 取样后 通 过 显微 镜 鉴定 即可确诊。如 需对 没有 明显 症状的 蜂群 进行 早期 诊断 或例行 蜂场 的病 害监 控则 可采用PCR 鉴定 的方 法。症状 DB 1301/T 361 2020 2 4.2.1 蜂群症 状 4.2.1.1 急性重 症感 染 当蜂群 感染 处于 后期 重症 阶段时 有如 下症 状：a)蜂群粪 便：蜂箱 外壁 或周 围地面 会出 现大 量棕 色 约0.5 cm 长 的细 长条 状粪 便 痕迹；b)蜂群表 现：在蜂 巢入 口处 及蜂场 地面，会 见到 患病 爬行的 和死 去的 蜜蜂。4.2.1.2 轻度感 染 除了部 分成 年蜜 蜂在 蜂箱 外爬行 外，没有 其他 异常 表现。4.2.2 蜜蜂个 体症 状 蜜蜂个 体感 染病 原后 可通 过如下 症状 进行 初步 判 断。a)病蜂活 动状 况：患病 蜜蜂 表现出 行动 迟滞，腹 部膨 大，飞 翔无 力等 症状。b)用镊子 从具 有典 型症 状的 蜜蜂腹 部末 端夹 出中 肠及 后肠仔 细观 察。健康 蜜蜂 中肠正 常呈 棕色，环纹明 显，并且 具有 弹性 和光泽。如 观察 到蜜 蜂中 肠膨大，呈 乳白 色，环纹 不清，失去 弹性 和光泽，即可 初步 确定 为蜜 蜂微孢 子虫 病。实验室 鉴定 4.3.1 显微镜 鉴定 4.3.1.1 样品处 理 将采集 的蜜 蜂样 本，分离 腹部置 于研 钵中，加 入5 mL 10 mL 蒸馏 水研 磨。取 研磨的 组织 涂片，在明场或 相差 光学 显微 镜下 以400 倍600 倍 进行 检查。4.3.1.2 鉴定 4.3.1.2.1 初诊 如在视 野中 见到 长约5 m 7 m，宽约3 m 4 m，椭圆 形的 孢子，边 界折 光明显，则 可初 步确诊。4.3.1.2.2 鉴别 按SN/T 1683 相 关方 法与 酵 母、真 菌孢 子、脂肪 体或 马氏管 变形 虫囊 包进 行鉴 别。4.3.2 PCR 鉴定 4.3.2.1 DNA 提取 提取缓 冲液 配方 见表1。表1 DNA 提 取缓 冲液 配方 试剂名称 浓度 CTAB 0.03 M Tris 0.05 M EDTA 0.01 M 注：缓冲液最终用ddH2O 将pH值调至8.0。DB 1301/T 361 2020 3 表1（续）试剂名称 浓度 NaCl 1.1 M 注：缓冲液最终用ddH2O 将pH 值调至8.0。操作步 骤如 下：a)取蜜蜂 的中 肠（取样 部位 见图 1），置于 一个 预冷 的（加 入液 氮）1.5 mL 离 心管中 并匀 浆；b)离心管 中加 入300 L 提 取 缓冲液 以 及4 L 20 mg/mL 的蛋 白酶K 溶 液，置 于 60 水 浴3 h；c)加入等 体积（300 L）的 苯酚:氯仿 为1:1 的混 合 液并轻 轻混 匀，13 000 rpm 离心15 min；d)将上清 液移 至另 一个 新管 中，沉 淀物 重复 用苯 酚:氯 仿为1:1 的混 合液 混匀 并离 心 1 次，合并2 次 的上 清液；e)加入预 冷 的600 L 95%的 乙醇后 加 入30 L 3 mol/L 的 NaOAc，轻 轻混 匀，置于-20 下过夜；f)10 000 rpm 离心 15 min，移去上 清液，沉 淀 用 1 mL 70%的 乙醇 洗涤 两次；g)烘干10 min 后 加入30 L ddH2O，置 于65 水 浴 10 min，轻轻 溶解 混匀 管中 的沉淀 物；h)10000 rpm 离心10 s 以 除 去未溶 解的 物质，即 得蜜 蜂中肠 组织 的DNA；i)提取 的DNA 溶液 置于-20 保存，备 用。标引序号说明：A 中肠；B 小肠；C 后肠；D 蛰针。图1 蜜蜂中 肠取 样部 位 4.3.2.2 PCR 扩增 将前步 所提 取的DNA 样品 稀 释5倍 进行PCR 反 应，反应 体系及 引物 按附录A（表A.1、A.2）执行。将15 L PCR 反 应体 系准 确吸 取 至PCR 板孔 中，设定 反应 程 序为：a)94 2.5 min；b)94 15 s，61.8 30 s，72 45 s，共 36 个 循 环；c)72 延伸7 min。4.3.2.3 扩增产 物的 分离 与鉴 定 扩增产 物通过2.0%的 琼脂 糖凝胶 电泳 进行 分离，GoldView 染色，照 胶。4.3.2.4 诊断结 果与 辨别 通过以 下凝 胶中 电泳 条带 的位置 可最 终判 别蜜 蜂是 否感染 微孢 子虫 病原 及种 类：a)只有当 凝胶 中115 bp 位 置 有明显 条带 时结 果可 信；b)当凝胶 中 在218 bp 位置 有 明显条 带时 即可 认为 样品 中含有 东方 蜜蜂 微孢 子虫；c)当凝胶 中 在321 bp 位置 有 明显条 带时 即可 判定 样品 中含有 蜜蜂 微孢 子虫。DB 1301/T 361 2020 4 取样 4.4.1 取样数 量 为保证 所收 集的 样品 具有 代表性，应 按以 下标 准确 定样品 数量。a)蜂群数 量 50 群（含）以 下 的蜂场 选 取 1 群 取样，每 群蜂取 样 约 20 只30 只 蜜蜂；b)蜂群数 量 50 群 以上 的蜂 场 选取 3 群取 样，每群 蜂取 样约 20 只30 只蜜 蜂。4.4.2 取样方 法 不同的 取样 目的 应分 别遵 循如下 方法 收集 样品。a)非定量 诊断 时，直接 从蜂 巢入口 附近 选取 具有 典型 症状的 成年 蜜蜂。b)定量调 查蜂 群受 感染 程度 时，随机 选取 蜂群 并随 机 提取群 内1 张巢 脾，随 机 抓取脾 上的 成年 蜜蜂。4.4.3 样品保 存 常温、干燥 保存 于纸 盒内。5 防控 蜂场场 址选 择 蜂场场 址按GB/T 19168 给 出的要 求进 行选 择。饲养管 理 5.2.1 饲料 5.2.1.1 春繁饲 料 春繁期 饲喂 蜂蜜 花粉 时，不使用 来历 不明 的花 粉，饲喂前 应对 花粉 进行 不少 于20 min 的蒸 汽消 毒。5.2.1.2 越冬饲 料 为蜂群 储备 越冬 饲料 时应 遵循如 下原 则：a)饲 喂 越冬 饲 料前 应对 蜂 群内 贮 存的 饲 料进 行显 微 镜检 查，如 巢 脾中 的蜂 蜜 或花 粉 中发 现 有 微孢子虫 则应 对巢 脾及 饲料 进行消 毒；b)补饲选 择蜂 蜜或 白糖；c)越冬饲 料，每个 蜂群 应至 少有 1 个封 盖蜜 的蜜 脾。5.2.2 预防消 毒 在饲养 环节 中应 通过 以下 措施以 保证 蜂群 的卫 生健 康。a)养蜂器 具：春繁 前应 对养 蜂器具 进行 修整，巢 框、巢脾及 起刮 刀等 养蜂 器具 用 2%3%氢氧 化钠溶液 浸 泡30 min 后清 水 清洗晾 干再 使用。蜂 箱消 毒可用 火焰 喷灯 灼烧 至微 变色。b)巢脾、蜂 箱：长期 保存 的 巢脾应 至于 空蜂 箱中，蜂 箱应整 齐叠 放并 将所 有缝 隙密封，然后 将盛有50 mL 浓度 4%冰醋 酸 的 容器放 入蜂 箱进 行熏 蒸消 毒。c)病死蜂：随 时收 集蜂 场地 面的病 蜂及 死蜂，集 中焚 烧或深 埋，并在 蜂场 地面 撒生石 灰消 毒。监测 DB 1301/T 361 2020 5 每年从 去除 越冬 包装 后开 始，直 至下 次越 冬包 装前，应至 少每3个 月对 蜂群 进 行1 次蜜 蜂微 孢子 虫病的病 原监 测，定量 调查 蜂群受 感染 程度。根 据上 两个年 度的 监测 记录 及当 前监测 结果 随时 调整 本 年 的防控措 施。防治 5.4.1 预防 结合蜂 群的 饲喂，将1 g 食 品级柠 檬酸 粉剂 加入1 000 g 饲料 中，持续 饲喂7 d。5.4.2 治疗 当蜂群 出现 大量 因排 泄不 畅的爬 蜂时，取4 g 大 黄苏 打片，溶 于1 000 mL 浓度为1:1 的蔗 糖水 中，喷脾，每 张脾100 mL。大流 蜜期内 及之 前1 个月 内不 得使用。DB 1301/T 361 2020 6 A A 附录A（规范 性）PCR 反 应体 系及 引物 序列 A.1 PCR 反 应体 系PCR反 应体 系试 剂配 比 按 表A.1执行。表A.1 PCR 反 应体 系试 剂配 比 试剂 剂量（L）浓度 5PCR buffer 3 引物 6 10 M One Taq 聚合酶 0.2 5 U/L dNTPs 0.5 10 mM DNA 模板 2 ddH2O 3.3 注1：3 对引物的正负引物各1 L。注2：反应体系15 L。A.2 引物序 列反应体 系中 各引 物的 序列 信息及 扩增 产物 大小 见表A.2。表A.2 引物序 列及 扩增 产物 信息 病原名称 Forward Primer Reverse Primer 产物大小（bp）东方蜜蜂微孢子虫（Nosema Ceranae）CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG 218 蜜蜂微孢子虫（Nosema Apis）GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG 321 内参基因（RpS5）AATTATTTGGTCGCTGGAATTG TAACGTCCAGCAGAATGTGGTA 115 石家庄市地方标准 蜜蜂微孢子虫病防治技术规程DB1301/T 3 612020河北省标准化研究院编辑、校对石家庄市工农路 368 号（0311-67501107）网站：BZSB.INFO 2020年12月第一版 DB1301/T 3612020