ICS 67.080.20 B 31 DB36 江西省地方标准 DB36/T 1398-2021 可食动物 肌肉和肝 脏中利巴 韦林及其 代 谢物残留 量的测定 液相色谱-串联质谱 法 Determination of residues of ribavirin and its metabolite in edible animal muscle and liver HPLC-MS/MS method 2021-04-23 发布 2021-11-01 实施 江 西 省 市 场 监 督 管 理 局 发布DB36/T 1398-2021 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 原理.1 4 试剂 和 材料.1 5 仪 器和 设备.2 6 试 样制 备与 保存.3 7 分 析步 骤.3 8 结 果计 算.5 9 方 法灵 敏度、准 确度 和 精密度.5 附录 A（资料 性）利巴 韦 林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺 和 13C5-利巴韦 林定 量离子 色谱 图.6 DB36/T 1398-2021 II 前 言 本 文件是按照GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构 和起草规则 的规定 起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利，本 文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由江 西省 农业 农村 厅提出 并归 口。本文件 起草 单位：江 西省 农业科 学院 农产 品质 量安 全与标 准研 究所，南 昌市 农业科 学院 本 文件 主要 起草 人：徐俊，胡丽 芳，侯玉 洁，费丹，周瑶 敏，邬磊，罗 林广，姚瑶，董 秋洪，尹 德凤，魏 爱花，万 伟杰，郭 孝培，谢敏，余 云云。DB36/T 1398-2021 1 可 食动物 肌肉和肝 脏中利 巴韦林及 其代谢 物残留量 的测定 液 相色谱-串联 质谱法 1 范围 本文件 规定 了动 物 可 食性 组织中 利巴 韦林 及其 代谢 物残留 量 液 相色 谱-串联质 谱测定 方法。本文件 适用 于 可 食动 物肌 肉、肝 脏中 利巴 韦林 及其 代谢物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺 残留 量的 测定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 原理 试样中 利巴 韦林 及其 代谢 物1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺采用1%乙酸-甲醇 提取，经乙 二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十 八烷 基硅 烷（C18）分 散净 化，浓 缩 定容后，液 相色 谱-电喷雾 串联质 谱测 定，同位 素内标法定 量。4 试剂 和 材料 水符合GB/T 6682 规定 的一 级水。4.1 试剂 4.1.1 甲醇：色谱 纯。4.1.2 甲酸：色谱 纯。4.1.3 乙酸铵：色 谱纯。4.1.4 乙酸：色谱 纯。4.2 溶液配制 4.2.1 2 mmol/L 乙酸铵溶液：称取 约 154 mg 乙酸 铵（4.1.3），加 水溶 解，转移 至 1000 mL 容量瓶中，定容至 刻度，混 匀。4.2.2 1%乙酸 溶液：量 取 1 mL 乙酸（4.1.4），加水 稀释，转 移 至 100 mL 容量瓶中，定 容至 刻度，混匀。4.2.3 1%乙酸-甲醇 溶液：量取1 mL 乙酸（4.1.4），用甲 醇（4.1.1）稀 释，转移 至100 mL 容量瓶中，用甲醇（4.1.1）定容 至刻 度，混 匀。DB36/T 1398-2021 2 4.3 标准品 4.3.1 利 巴韦 林（Ribavirin，CAS：36791-04-5），纯度 98.0%。4.3.2 1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺（TCONH2，CAS：3641-08-05），纯度 98.0%。4.3.3 13C5-利巴韦 林（13C5-Ribavirin，CAS：1646818-35-0），纯度 99.0%。4.4 标准溶液 的 配制 4.4.1 100 mg/L 标准储备 液：分别 准确 称取 利巴 韦 林和 TCONH2标 准物 质 各 1 mg（精确 至 0.1 mg），分别 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇 配制 成 100 mg/L 的标准储 备液，于-18 下保 存，有效期 6 个 月。4.4.2 1 mg/L 混合标准中 间液：分别 准确 吸取 1 mL 标准储 备液（4.4.1）于 100 mL 容量瓶中，用 甲醇稀释至 刻度，摇 匀得 到 1mg/L 的混合标准 中间 液，于 4 下保 存，有效 期 3 个月。4.4.3 100 mg/L 内标储备 液：准 确称 取13C5-利巴 韦 林标准 物质 约 1 mg，精密 称定，于 10 mL 容量瓶中，用 甲醇 配置 成 100 mg/L 的内标储备 液，于-18 下保存，有效期 6 个月。4.4.4 1 mg/L 内标中间液：用 移液 管吸 取内 标准 储 备液（4.4.3）1 mL 于 100 mL 容量瓶中，用甲 醇稀释至刻 度，摇匀 得 到 1 mg/L 的内标中间 液，于 4 下保存，有 效 期 3 个 月。4.4.5 200 g/L 内标工作 液：用移 液管 吸取 内标 中 间液（4.4.4）2 mL 于10 mL 容量瓶 中，用 甲醇 稀释 至刻度，摇匀 得到200 g/L 的 内标工 作液，临 用现 配。4.4.6 标 准工 作溶 液：根 据每种 标准 的灵 敏度 和线 性范围，移 取适 量的 混合 标准中 间液（4.4.2）和内标中间 液（4.4.4），用溶 剂稀释 至合 适 浓 度，临用 现配。4.5 材料 4.5.1 乙 二胺-N-丙基硅 烷（PSA），粒 径 40 m-60 m。4.5.2 十 八烷 基硅 烷（C18），粒径 40 m-60 m。4.5.3 微 孔滤 膜：有机 相，0.22 m。5 仪器和 设备 5.1 液相色 谱-电喷 雾串 联质 谱：配电 喷雾 离子 源。5.2 组织均 质器。5.3 分析天 平：感 量0.1 mg 和0.01 g。5.4 高速冷 冻离 心机：转 速不 低于 5000 r/min。5.5 氮吹仪。5.6 涡旋仪。6 试样制 备与 保存 6.1 试样的 制备 取动物 肌肉、肝 脏样 品约500 g 用 组织 均质 器 搅 碎，装入洁 净容 器作 为试 样，密封。6.2 试样的 保存 将试样 于-18 保 存。7 分析步 骤 DB36/T 1398-2021 3 7.1 提取 称取约1 g（精确 至0.01 g）样品于50 mL 聚乙烯管中，加入内 标 工 作液（4.4.5）50 L，加入5 mL 1%乙酸-甲醇溶 液（4.2.3），涡旋1 min，5000 r/min 离心5 min，取上清液 于15 mL 离心管 中。离心 后的 残渣加入5 mL 1%乙酸-甲醇溶 液（4.2.3），重 复提 取一 次，合 并上 清液，混 匀。7.2 净化 将7.1 所得 合并 上清 液加入50 mg PSA 和50 mg C18 吸 附剂，涡旋30 s，然 后在5000 r/min 离心5 min，收集上 清液 至离 心管 中并在45 条件 下氮 气吹 至近干，残 渣用1 mL 水溶解，放置1 min 后涡 旋30 s，经0.22 m 滤膜过 滤，供测定。7.3 色谱质 谱参 考条 件 7.3.1 液相色 谱参 考条 件 如 下：a）色 谱柱：ZORBAX SB-Aq（100 mm 3.0 mm，1.8 m），或性能 相当 者；b）流 动相：流 动相A 为2 mmol/L 乙酸铵溶 液（含0.1%甲酸）；流动 相B 为甲 醇；c）流 速：0.4 mL/min；d）柱 温：35；e）进 样体 积：5.0 L；f）流动 相和 梯度 洗脱 条件 见表1。表 1 液相 色谱 梯度 洗脱 参 考条件 时间，min 流动相 A，%流动相 B，%0 100 0 2.5 100 0 3.5 2 98 6.0 2 98 7.0 100 0 7.3.2 质谱参 考条 件 如 下：a）离 子化 模式：电 喷雾 电 离正离 子模 式（ESI+）；b）毛 细管 电压：3000 V；c）干 燥气 温度：150；d）干 燥气 流量：15 L/min；e）雾 化气 压力：35 psi；f）鞘气 温度：300；g）鞘 气流 量：11 L/min；h）检 测方 式：多反 应监 测（MRM），监测 条件 见 表 2。表 2 利巴 韦林、TCONH2和13C5-利巴韦 林质 谱参 考 参数 被测物名称 母离子，m/z 子离子，m/z 碎裂电压，V 碰撞能，eV 利巴韦 林 245.1 113*380 10 96 380 30 TCONH2 113 96*380 20 69 380 25 13C5-Ribavirin 250 113*380 8 注：*为定量离子对。DB36/T 1398-2021 4 7.4 标准工 作曲 线 吸取一 定量 标准 中间 溶液，用 水逐 级稀 释成 质量 浓 度为0.2 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L 的标 准工作 溶液，其 中含13C5-利巴 韦 林 浓度 均为10 g/L，供液 相色谱-串联 质谱 仪测 定。以利巴 韦林 及其 代谢 物的 定量离 子对 和内 标13C5-利巴韦林 的峰 面积 之比 为纵 坐标，以标 准工 作液 的浓 度作为横 坐标，绘 制标 准曲 线。7.5 定性及 定量 7.5.1 保留时 间 被测试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在 2.5%之 内。7.5.2 定量离 子、定性 离子 及子 离子丰 度比 在相同 实验 条件 下进 行样 品测定 时，如果 检出 的色 谱峰保 留时 间与 标准 品相 一致，并且 在扣 除背 景后的样 品质 谱中，目标 物 的质谱 定量 和定 性离 子均 出现，而 且同 一检 测批 次，样 品中 目标 物的 定性 离 子和定量 离子的 相对 丰度比 与质量 浓度相 当的 标准溶 液相比，其允 许偏 差不超 过表3 规 定的 范围，则可 判定为样 品中 存在 对应 的待 测物。表 3 定性 确证 时相 对离 子丰度 的最 大允 许偏 差 相对离子丰度，%50 2050（含）1020（含）10 允许的最大偏差，%20 25 30 50 7.5.3 定量测 定 内标法 定量：用标 准工 作 溶液分 别进 样，以 分析 物 和内标 物的 峰面 积比 为纵 坐标，以 分析 物和 内标物的浓 度比 为横 坐标 作标 准工作 曲线，用 标准 工作 曲线对 样品 进行 定量，标 准工作 液和 待测 工作 液 中 目标物的 响应 值均 应在 仪器 检测的 定量 测定 线性 范围 之内，超过 线性 范围 时应 根 据测定 浓度 进行 适当 倍数稀释后再进行分析。在 上 述色谱-质谱条件下，利巴韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和13C5-利巴韦林标准溶液 定量 离子 色谱 图参 见附录A。7.6 空白试 验 除不加 试样 外，均按 上述 步骤进 行。8 结果计 算 试样中 利巴 韦林 和TCONH2的残留 量按 式（1）计算。10001000 mVX（1）式中：X 试样 中 利 巴韦 林和 TCONH2的 含量，单 位为 微克 每千克(g/kg)从 标准 曲线 中查 得的 试 样提取 溶液 中 利 巴韦 林和TCONH2的 浓度，单 位为 微 克每升(g/L)；DB36/T 1398-2021 5 V 样液 最终 定容 体积(mL)；m 所取试样 的量，单 位 为克(g)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9 方法灵 敏度、准 确度 和精 密度 9.1 灵敏度 本方法 对利 巴韦 林及 其代 谢物的 检出 限：肌肉 为0.05 g/kg，肝脏 为0.1 g/kg。本方法 对利 巴韦 林及 其代 谢物 的 定量 限：肌肉 为0.2 g/kg，肝 脏为0.5 g/kg。9.2 准确度 本方法 在0.5 g/kg-5.0 g/kg 添加 浓度 水平 上的 回收 率 为93.85%-113.92%。9.3 精密度 在重复 性条 件下，2 次独 立测定 结果 与其 算术 平均 值的绝 对差 值不 大于 该算 术平均 值 的 15%。DB36/T 1398-2021 6 附录A（资料 性）利巴韦 林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰 胺和13C5-利 巴韦 林定量 离子 色谱 图 图A.1 利巴 韦林、1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺和13C5-利巴韦林标 准溶 液(10.0 g/L)定量离子 色谱 图 1-利巴韦林 定量 离子 色谱 图（245.1113）2-1H-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺 定量 离子 色谱 图（11396）3-13C5-利巴韦林 定量 离子 色谱图（250113）_